【法宝引证码】CLI.1.304262
【时效性】尚未施行
深圳市卫生和人口计划生育委员会关于印发《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南(试行)》的通知
- 制定机关： 深圳市卫生和计划生育委员会(原市卫生和人口计划生育委员会)
- 发文字号：深卫人发〔2011〕82号
- 公布日期：2011.01.27
- 施行日期：2011.01.27
- 时效性： 现行有效
- 效力位阶： 地方工作文件
- 法规类别： 传染病防治 疫情防控
深圳市卫生和人口计划生育委员会关于印发《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南（试行）》的通知
（深卫人发〔2011〕82号）
各区卫生局，光明、坪山新区公共事业局，委直属各医疗卫生单位：
为通过采取积极有效的预防控制措施，预防流感、人禽流感及SARS等重大呼吸道传染病暴发流行，保障广大市民身体健康和社会经济发展稳定，根据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》、《广东省流感监测方案（2010年版）》要求，结合我市实际，我委组织专家制定了《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南（试行）》，现印发给你们，请认真贯彻执行。
二〇一一年一月二十七日
深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南（试行）
(深圳市卫生和人口计划生育委员会 二〇一一年一月)
(深圳市卫生和人口计划生育委员会 二〇一一年一月)
目录
第一章 项目背景和意义
第二章 目标和实施原则
第三章 组织机构和部门职责
第四章 项目内容和产出
第五章 经费预算和管理
第六章 督导和质量控制
第七章 附件
项目背景
本项目主要包括流行性感冒（简称流感）、人感染高致病性禽流感（简称人禽流感）、传染性非典型肺炎（简称SARS）、麻疹、风疹及其它病毒引起的呼吸道传染病和军团病等细菌性呼吸道传染病。流感、人禽流感及SARS等重大呼吸道传染病是严重影响人民群众健康和社会经济发展的公共卫生问题。其中SARS和人禽流感是《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类管理；甲型H1N1流感和麻疹为乙类传染病，季节性流感和风疹为丙类传染病；甲型H1N1流感被纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。多年来国家卫生部和广东省卫生厅制定了一系列法律法规和方针政策，指导呼吸道传染病的预防控制工作，国家和广东省疾控中心针对流感、麻疹等下发了统一的监测方案，对人禽流感和SARS等出台了多个预防控制方案和应急预案，对各种呼吸道传染病的防治工作提出了具体要求。深圳市各级政府和卫生行政部门多年来高度重视呼吸道传染病的预防控制工作，建立了完善的监测和防制网络，经过多年的运行和不断改善，经历了2003年SARS暴发，2006年人禽流感和2009年甲型H1N1流感暴发等重大疫情的严峻考验，也已取得了显著的工作成效。
流感及其它呼吸道传染病的共同特点是：具备极强的传染性，经飞沫和接触传播，传播速度快，容易引起暴发和流行。其中流感是全球范围内发病人数最多、流行范围最广、对人类危害巨大的一种传染病，以潜伏期短、传染性强，传播迅速，人群对变异株普遍易感为特征。流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其中甲型流感变异频繁，可周期性引起世界性流感大流行。上世纪曾发生过四次世界范围内的流感大流行，每次流感大流行都对人类和整个社会带来了巨大的损失。其中1918年的“西班牙流感”大流行是流感流行史上最严重的一次，全球共有超过2100万人死亡。据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年流感感染病例达6～12亿，造成的严重病例达300～500万，死亡病例25～50万。2009年3月底，甲型H1N1流感在墨西哥引起暴发流行，随即迅速传播到美国、欧洲、亚洲及世界各地，6月11日世界卫生组织宣布世界流感大流行的到来，截至到2010年3月19日，全球共有213个国家或地区报告了确诊的甲型H1N1病例，至少死亡16813人。
禽流感是由甲型流感病毒引起的一种禽类传染性疾病综合征，我国将其列为一类动物疫病。该病毒的某些亚型可以感染人类，引起以呼吸系统症状为主的急性传染病。其中由H5或H7亚型毒株所引起的人类流感称为人感染高致病性禽流感。1997年香港发生了高致病性禽流感病毒H5N1亚型感染人并致人死亡事件，这是人类首次发现该亚型的禽流感病毒感染人类，此后香港又出现多例类似患者；2003年以来，人感染禽流感疫情相继在包括我国大陆地区在内的许多国家和地区出现，同时在动物间的禽流感也呈现蔓延趋势，WHO的专家预测，H5N1病毒发生变异时可能会感染全球30%的人口，并导致200万至700万人口死亡，超过10亿人患病。
传染性非典型肺炎（SARS）是一种因感染SARS相关冠状病毒而导致的以发热、干咳、胸闷为主要症状，严重者出现快速进展的呼吸系统衰竭，是一种新的呼吸道传染病，极强的传染性与病情的快速进展是此病的主要特点。2003年SARS的暴发流行给全球造成了巨大的危害，根据世界卫生组织的数据显示，全球累计非典病例共8422例，涉及32个国家和地区。全球因非典死亡人数919人，病死率近11％。中国内地累计病例5327例，死亡349人。
1976年美国发生军团菌病暴发后，军团菌病在全世界许多国家都有报道。美国、欧洲也相应建立了军团菌病监测网络。2003年，欧洲的36个国家中34个（人口：4.6776亿）国家总共报告了4，578例军团菌病例，全欧洲军团菌病平均发病率为9.8/10万。共报告有189起院内感染、社区感染和旅游相关的军团菌病的暴发。我国也建立了军团菌病监测网络。
深圳市作为我国改革开放的窗口城市，毗邻港、澳地区，经济发达，外来人口众多，并且是交通密集型城市。深圳市人口密度大，是我国最大的陆路进出口岸之一，人口流动性强，国际接触频繁，这些都会加速呼吸道病原体的传播和扩散。2009年甲型H1N1流感在全球暴发流行，我市共报告2064例确诊病例，其中境内感染1871例，境外感染193例 ，5例死亡。深圳2006年已发生首例人感染高致病性禽流感疫情，而且深圳的很多外来人口来自禽流感疫情发生地，具备禽流感病毒快速传播的条件，所以必须进一步加强流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作。
2003年SARS流行期间，全市累计收治SARS临床诊断病例53例、疑似病例69例和医学观察病例206例。53例临床诊断SARS病例中，共有19例可查到接触史，其中4例在广州感染，6例在香港感染，1例在北京感染，8例在深圳本地感染。
鉴于流感病毒不断变异的性质，无法准确预测大流行发生的时间和严重程度。我们亟待建立一个灵敏有效的流感及人禽流感预警系统，以发现病毒行为方面改变的最初迹象。监测是目前预防流感及人禽流感最为有效的措施之一。通过监测可以动态观察流感及人禽流感的活动情况，及早发现疫情，将损失降到最低，切实保障社会的稳定和人民群众的生命安全。 深圳市流感及人禽流感防控工作发展
（一）建立健全流感监测网络
深圳市自1985年开始进行流感监测工作。 1994年10月，市疾病预防控制中心（原市卫生防疫站）正式成为WHO和国家流感中心（NIC）流感监测成员单位，2000年加入广东省流感监测网络。20多年来，在流感监测和疫情处理方面积累了丰富的经验。2005年5月，组建了深圳市的市区两级流感监测网络，当时有19个成员单位，2006年扩增到29家，2008年增加至31家。全市流感监测网络涵盖市及区疾控中心、市及区综合医院、社区健康中心、学校和家禽养殖场等不同性质机构，进一步提高了监测的代表性和灵敏性，有助于及时掌握全市的流感病毒流行特征和发展趋势，为及早发现流感病毒变异提供了最快捷、最可靠的综合平台。
（二）建立了流感样病例暴发疫情监测系统
市疾病预防控制中心建立了由市、区、街道疾病预防控制机构组成的暴发疫情监测系统，对流感样病例暴发疫情进行全面的调查处理、追踪分析和检验研究工作。经过几年运作，该系统日趋完善稳定，为我市流感及人禽流感预防控制提供了重要参考依据。
（三）建立了较为完善的检验研究技术平台
目前我市已建立包括细胞及鸡胚培养、病原体鉴定、抗原及抗体检测、PCR快速诊断、核酸序列分析、蛋白质组分析等技术，可对流感及人禽流感、SARS以及其他常见呼吸道疾病进行检验分析。
（四）专业队伍建设
我市已构建起一支由疾控、医院、社康中心、学校、动物防疫等专业人员组成的100余人的流感及人禽流感防制队伍。
尽管我市呼吸道传染病监测和防制工作已有较好基础，但仍存在不足：一是呼吸道传染病往往传播迅速，病情发展快，致死率高，导致全市呼吸道传染病防制工作在疫情发生时面临着任务艰巨，人手不足等困难；二是呼吸道传染病的初期症状特异性不高，多以发热为主要症状，要求平时对医疗机构发热门诊正常运转，医生能迅速识别人禽流感、SARS等病人；三是医疗卫生机构的呼吸道病原学检测工作有待加强；四是由于很多呼吸道疾病与动物相关，一些新发的呼吸道疾病多由输入性病人的引发本地的暴发流行，因此与农业、出入境检验检疫等部门的协调合作需进一步加强；五是在引起呼吸道传染病的病原体中，还有很大一部分如冠状病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、间质肺病毒、鼻病毒、腺病毒等未开展常规的检测，需进一步提高疾控机构对不明原因病原体的检测水平。 项目意义
综上所述，流感、人禽流感和SARS等呼吸道传染病监测和防制工作是国家依法规定的指定性任务，深圳也是国家级流感监测哨点，做好流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作，对保障全市人民健康和社会经济发展具有重要意义。 目标
（一）总目标
通过推广执行《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南》，掌握我市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的发生发展规律，了解其抗原性和基因特性变异，及早发现变异株，为政府提供流感及人禽流感等重大呼吸道传染病防治工作的决策依据。
（二）具体目标
1、建立健全我市重点呼吸道传染病监测报告网络，以及评估、预警体系；
2、开展一般人群和职业人群流感、人禽流感血清学抗体监测，掌握流感流行毒株的型别，分子变迁与流行关系，掌握人群流感免疫水平的现状；
3、建立实时敏感的人禽流感监测系统，及时发现和控制人禽流感疫情，建立快速有效的SARS检测系统，识别和预警可能的暴发和流行，对可疑病例进行排查，建立灵敏、快速的不明原因病毒性肺炎病例检测系统，及时发现肺炎相关病原体；
4、健全麻疹、风疹监测网络系统，及时了解麻疹、风疹的流行状况，有效控制麻疹、风疹发病率；
5、开展军团病病原学检测，识别和预警可能的暴发和流行；
6、开展水痘病原学检测，识别和预警可能的暴发和流行。 实施原则
（一）依法实施
根据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《卫生部应对流感大流行准备计划与应急预案》、《全国流感监测方案（2010年版）》、《广东省流感监测方案（2010年版）》、《深圳市流感监测方案（2006年版）》和《深圳流感大流行应急预案》等文件要求制定方案并进行实施、管理。
（二）政府主导
流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的发生和流行是一个重要的公共卫生问题，各级政府加强领导，市、区财政共同承担并落实项目配套经费，各级卫生行政部门明确职责，各级疾病预防控制和医疗机构要把流感、人禽流感等重大呼吸道传染病防治工作抓紧抓好。
（三）统筹规划
根据国家和广东省流感及人禽流感预防控制方案，结合深圳市的实际情况，由市疾病预防控制中心负责《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南》的制定，并作为全市疾病预防控制工作的重要组成部分。还应根据实际病例的发病和流行情况，及时调整和完善监测与防治方案，进一步强化流感、人禽流感等重大呼吸道传染病防治的专业技术培养，确保此项工作的顺利开展。
（四）辖区管理
一方面应该按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定，流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的病例报告、调查处理等实施过程遵循辖区管理原则；另一方面，按照我市现行财政管理模式实行统一计划、各级财政分级核拨的原则执行。 组织机构
本项目在市政府领导下和市卫生和人口计划生育委员会指导下组织实施，市疾病预防控制中心作为本项目的执行单位，负责日常运转工作；各区疾病预防控制中心（含街道预防保健所）、医疗及其他机构按照各自的职能承担并完成相应的工作任务。 部门职责
（一）市卫生和人口计划生育委员会
1、制定全市有关文件、方案、工作指标及考核标准；
2、根据监测结果，适时发布暴发和流行预警；
3、当暴发和流行发生时，适时启动预案，协调和调动市、区各级疾控、医疗机构，参与疫情控制；
4、组织全市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病预防控制工作的检查和考核；
5、定期召开流感、人禽流感等重大呼吸道传染病预防控制工作总结表彰和研讨会议。
（二）区卫生行政部门
1、制定辖区有关文件、方案、工作指标及考核标准；
2、组织本区各疾控、医疗机构开展流感、人禽流感等重大呼吸道传染病暴发和流行的调查处理；
3、组织辖区流感、人禽流感等重大呼吸道传染病预防控制工作的检查和考核；
4、定期召开辖区流感、人禽流感等重大呼吸道传染病预防控制工作总结表彰和研讨会议。
（三）市疾病预防控制中心
1、负责《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目工作指南》的起草、修改和完善，为监测和防治提供技术指导和支持；
2、确定监测网络统一的监测和检测方法，组织对全市各监测单位的专业技术人员培训；
3、负责监测数据的收集、整理，定期对监测系统的全部数据进行分析和反馈；
4、负责当地重大流感样病例暴发疫情的流行病学调查及实验室快速诊断检测和病原体分离培养；
5、负责流感毒的分离培养鉴定、分析研究及上送国家流感中心；
6、负责全市一般人群、职业人群的流感及人禽流感血清抗体水平监测评估；
7、参加卫生行政部门组织的定期或应急性工作检查和考核评估，确保流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的预防控制工作的质量；
8、每年对项目执行情况和技术进展进行年度总结和评估。
（四）区疾病预防控制中心
1、负责辖区内本项目的实施，组织协调和督导工作；
2、组织对辖区内各有关监测单位专业技术人员的培训；
3、负责辖区内监测数据的收集、整理，定期对监测系统的全部数据进行分析和反馈；
4、负责辖区呼吸道传染病暴发疫情的流行病学调查及实验室快速诊断检测和病原体分离培养；
5、负责流感病毒的分离培养鉴定，将阳性毒株上送市疾病预防控制中心；
6、负责其它呼吸道病原体的分离培养和送检，有条件的实验室可对病原体进行进一步鉴定；
7、协助市疾病预防控制中心开展一般人群、职业人群的流感及禽流感血清抗体水平监测评估工作；
8、积极参加卫生行政部门组织的定期或应急性工作检查和考核评估，确保流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的预防控制工作质量；
9、每年对项目执行情况和技术进展进行年度总结。
（五）街道预防保健所
1、协助区级疾病预防控制中心落实辖区内的流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作；
2、协助各级疾病预防控制中心开展辖区内流感样病例暴发疫情的现场调查及采样送检工作。
（六）监测哨点医院
1、根据本指南要求在内科、儿科、急儿、急内以及发热门诊开展流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作，医生或护士负责就诊的流感样病例的登记、采样和填写采样登记表；市人民医院、深圳市妇幼保健院负责按比例按要求对住院肺炎患者进行登记和采样；
2、预防保健科专人负责统计内科、儿科、急儿、急内以及发热门诊就诊病例总数和流感样病例数，以周报形式报告辖区疾病预防控制中心（国家监测哨点医院报告至市疾病预防控制中心）；
3、按周按量采集流感样病例标本，并在24小时内送至市或区级疾病预防控制中心；
4、各监测医院加强流感及人禽流感和不明原因肺炎监测，发现流感样病例明显增多和不明原因肺炎病例时，立即报告辖区疾病预防控制中心；
5、定期开展自查自评工作，不断提高流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作质量。
（七）社区健康服务中心
1、根据本指南要求在内科、儿科开展流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测，医生或护士负责就诊流感样病例的登记和填报；
2、专人负责统计内科、儿科就诊病例总数和流感样病例数，以周报形式报告辖区疾控中心（市级哨点报告至市疾病预防控制中心）；
3、各社区健康服务中心加强流感及人禽流感和不明原因肺炎监测，发现流感样病例明显增多和不明原因肺炎病例时，立即报告辖区疾病预防控制中心；
4、定期开展自查自评工作，不断提高流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作质量。
（八）监测学校
1、学校医务室开展流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测，校医负责就诊流感样病例的登记和填报；
2、专人负责统计学校医务室的就诊病例总数和流感样病例数，以周报形式报告市疾病预防控制中心；发现流感样病例明显增多或不明原因群体性发热，立即报告市疾病预防控制中心；
3、定期开展自查自评工作，不断提高流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作质量。
（九）家禽饲养场及禽鸟批发市场
1、市属流感监测家禽饲养场、禽鸟批发市场指定专人负责每日收集流感样病例、肺炎病例数及缺勤工人总数以周报形式报疾病预防控制中心；
2、出现流感样病例、肺炎病例或家禽异常死亡情况，立即报告市疾病预防控制中心及填写家禽饲养场流感样病例、肺炎病例个案记录表和一览表；
3、定期开展自查自评工作，不断提高流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测工作质量。 监测
（一）监测网络的技术力量和组成
本项目由市、区疾病预防控制中心和宝安、龙岗各街道预防保健所，以及市、区、街道综合医院（监测医院）、社康中心、学校和家禽养殖销售市场组成。
（二）流感及其它呼吸道传染病监测的主要内容
1、流感及人禽流感
（1）流感样病例监测
①监测对象：流感样病例是指体温≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一者，缺乏其它实验室诊断依据的。
②监测哨点设置：全市在10家综合性医院/妇幼保健院，6家社区健康服务中心，3家学校和4家家禽饲养场/禽鸟批发市场开展流感样病例监测，具体监测哨点名单见下表：
深圳市流感监测哨点单位一览表
类型 | 单位名称 |
医院 | 市人民医院 |
市妇幼保健院 | |
罗湖区人民医院 | |
福田区人民医院 | |
南山区人民医院 | |
盐田区人民医院 | |
龙岗区人民医院 | |
宝安区人民医院 | |
公明人民医院 | |
布吉人民医院 | |
社康 | 草埔东社康服务中心 |
南光社康服务中心 | |
益田社康服务中心 | |
桥东社康服务中心 | |
横岗六约社康服务中心 | |
公明社康服务中心 | |
学校 | 深圳市实验学校小学部 |
深圳市外国语学校初中部 | |
深圳大学 | |
养殖场/禽鸟批发市场 | 布吉红晟禽鸟批发市场 |
正大康地坪西家禽养殖场 | |
正大康地坪东家禽养殖场 | |
南山农产品批发配送有限公司家禽批发市场 |
③监测哨点监测诊室要求：哨点医院和社康在内科门诊、内科急诊、发热门诊和儿内科门诊、儿内科急诊开展流感样病例监测，要求内科门诊的监测应当包括内科和感染性疾病科的所有科室，学校哨点在该校医务室开展监测。
④流感样病例报告：各哨点医院和社康监测诊室的医务人员，按照流感样病例的定义，每天按科室登记各年龄组的流感样病例数和门急诊就诊总数（附表1），由哨点医院主管科室每日收集、汇总后（附表3-1），于每周一将本院上周各监测诊室数据录入到“深圳市疾病控制信息管理系统”或“中国流感监测信息系统”；
哨点学校医务室每天登记该医务室就诊的流感样病例，并统计每天就诊的流感样病例数和内科病例总数（附表3-1），于每周一录入到“广东省急性传染病监测信息平台系统”；
家禽饲养场、批发市场每天登记该家禽饲养场、禽鸟批发市场的上呼吸道感染病例、流感样病例及肺炎病例，并统计每天上呼吸道感染病例、流感样病例、肺炎病例数及缺勤工人总数（附表3-2），于每周一录入到“深圳市疾病控制信息管理系统”或通过Email、传真发送至市疾控中心。
流感样病例数和门急诊病例就诊总数在每个监测诊室的产生来源必须一致。
（2）病原学监测
①标本采集
Ⅰ对象：流感样病人（发病3天内）、住院肺炎病人；
Ⅱ标本类型：鼻咽拭子或咽漱液、双份血清；
Ⅲ采样方法：
A 鼻咽拭子采集：取一盛有采样液（HanK’s液）的试管或塑料离心管，做好标记（包括就诊医院名称或患者住址、患者姓名、样本编号等内容）。鼻拭子是将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几秒钟以吸收分泌物；咽拭子是叮嘱患者将头部稍微后仰，张开口，用一已消毒压舌板将舌根往下压，同时用消毒干棉拭子深入双侧咽扁桃体及咽部后壁，擦拭5-8次，应避免触及舌部，采完后迅速将鼻咽拭子放到有旋转盖的并装有标本运输液的带垫圈的5ml螺口塑料冻存管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖。
B 咽漱液采集：取一螺口塑料离心管，做好标记（包括就诊医院名称或患者住址、患者姓名、样本编号等内容）。采样时用一洁净的一次性杯子或其它洁净容器盛6-8mL采样液（HanK’s液），倒入患者口中，叮嘱患者将头部稍微后仰，确保采样液流到患者咽喉部，张开口发出“啊”的声音十次左右，再将采样液吐回一次性杯子或其它洁净容器中，然后将采样液吸到已做标记的试管或塑料离心管中，塞紧胶塞或旋紧螺旋盖。
C双份血清采集：所采集的血液均放置在已做标记（包括就诊医院名称或患者住址、患者姓名、标本编号等内容）的干燥试管中，每次采集静脉血清1-2ml，第一份血清应在就医后24-48小时内采集，最迟不晚于发病后7天，第二份血清应在发病后10-14天采集。
Ⅳ 标本数量
每年3～9月市级每周10～15份（区级每周5～10份）、10月至次年2月为市级每周5～10份（区级每周3～5份），尽量避免集中、突击采样。深圳市人民医院及区级综合性医院注意对成人组流感样患者的登记和采样，每周成人的采集标本不能少于总采集数的50％（区级30%）。监测医院采集上送的流感样病例标本分离培养出流感病毒，每株奖励人民币40元（实验人员20元、采样人员20元）。
市人民医院、市妇幼保健院每周采集2～5份住院肺炎患者标本，同一患者尽可能采集双份标本，一份为鼻咽拭子用于常见呼吸道病毒的抗原检测，一份为双份血清用于常见呼吸道病毒的抗体检测。
Ⅴ保存、送检
采集人员填写《流感样病例采样送检表》（附表2-1）或《住院肺炎患者采样送检表》（附表2-2），采集的鼻咽拭子、血清标本要立即放在4～8℃条件下保存，并在24小时内送至疾病预防控制中心检测。
②病毒分离
Ⅰ 各区疾病预防控制中心对监测医院送检的鼻咽拭子或咽漱液标本在48小时内利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行流感病毒分离，阳性毒株用核酸检测进行型别鉴定，鉴定后各区疾控中心将所有符合报送标准的流感毒株报送市疾控中心，并附鸡胚及MDCK分离试验记录（附表4-1，4-2）及毒株送检表（附表5），每株病毒培养液不低于3毫升，采集标本后1个月内完成毒株鉴定和上送；
Ⅱ 市疾病预防控制中心对监测医院送检的鼻咽拭子或咽漱液标本在48小时内利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行流感病毒分离，阳性毒株用核酸检测进行型别鉴定，并将所有符合报送标准的流感毒株上送国家流感中心及广东省疾病预防控制中心，每株病毒培养液不低于3毫升，采集标本后1个月内完成毒株鉴定和上送；
对监测医院送检的住院肺炎病例鼻咽拭子标本在48小时内同时接种MDCK、LLC、HEP-2C细胞进行常见呼吸道病毒分离。
Ⅲ 结果报告：各疾控中心流感网络实验室接到标本后，48小时内将流感样病例采样送检表》（附表2-1）录入到“深圳市疾病控制信息管理系统”，在收样后1个月内录入病毒分离鉴定结果，及时将本市的病毒采样及分离情况统计、汇总（附表5），于每月5日前将上月情况上报市疾控中心。
（3）血清学监测
每年3月和9月份，各区疾病预防控制中心各按0～、5～、15～、25～和60～岁的年龄段分组，每组（每次）30份（每份血清标本量不少于1毫升），采集一般人群血清共150份，连同送检单按时上送市疾病预防控制中心进行各型及亚型的流感病毒血清抗体检测。
（4）暴发疫情监测 各级医疗卫生机构和企事业单位、学校、托幼机构医疗卫生保健人员发现短时间内出现异常增多的流感样病例时，辖区疾病预防控制中心组织开展当地流行病学调查及处理（附表7，附表8），采集鼻咽拭子或咽漱液及采集双份血清，进行实验室快速诊断检测（如PCR、胶体金、ELISA等技术）以及病毒分离培养，完成调查报告（附表9），必要时市疾病预防控制中心参与调查处理。
（5）职业人群和外环境监测 在城乡活禽市场、规模性的禽类养殖场（户）、禽类散养户集中地区、禽类屠宰加工厂（场所）设置监测点，包括职业暴露人群血清流行病学监测、环境标本高致病性禽流感病原学监测：每年冬春季对职业暴露人群（活禽批发市场、城乡农贸市场或菜市场中直接与禽类接触的人员、家禽规模养殖场（户）中直接与禽类接触的人员、家禽屠宰加工厂中直接与禽类接触的人员、家禽散养户的家庭成员）进行血清流行病学监测；每年的1、4、7、10月各采集监测点的水、禽类（含候鸟）粪便及笼具表面等环境标本1次进行A型流感病毒核酸检测，A型流感病毒核酸阳性标本进一步进行H5N1亚型检测，应及时将上述标本中所有A型流感病毒核酸阳性的标本送省疾控中心微检所。国家流感中心和省疾控中心将对全部A型流感病毒核酸阳性标本进行复核，并及时反馈。
进行流感样病例哨点监测的家禽饲养场或禽鸟批发市场出现流感样病例、肺炎病例或家禽异常死亡情况，立即报告市疾病预防控制中心及填写家禽饲养场流感样病例、肺炎病例个案记录表和一览表（附表3-3）。
2、SARS
（1）病例筛检 监测病例包括SARS疑似病例和临床诊断病例。具有下列六项之1＋3＋4条或2＋3＋5条或3＋4＋5条的为SARS疑似病例：1）与发病者有密切接触史，或属受传染的群体发病者之一，或有明确传染他人的证据；2）发病前2周内曾到过或居住于报告有传染性非典型肺炎病人并出现继发感染疫情的区域；3）起病急，以发热为首发症状，体温一般＞38℃，偶有畏寒；可伴有头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；常无上呼吸道卡他症状；可有咳嗽，多为干咳、少痰，偶有血丝痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速，气促，或明显呼吸窘迫。肺部体征不明显，部分病人可闻少许湿罗音，或有肺实变体征。注意：有少数病人不以发热为首发症状，尤其是有近期手术史或有基础疾病的病人；4）外周血白细胞计数一般不升高，或降低；常有淋巴细胞计数减少；5）肺部有不同程度的片状、斑片状浸润性阴影或呈网状改变，部分病人进展迅速，呈大片状阴影；常为多叶或双侧改变，阴影吸收消散较慢；肺部阴影与症状体征可不一致。若检查结果阴性，1～2天后应予复查；6）抗菌药物治疗无明显效果。符合上述条件的1＋3＋5条及以上或2＋3＋5＋6条或2＋3＋4＋5条的即为临床诊断病例。
（2）病原检索 一旦出现SARS疑似病例、临床诊断病例或实验室确诊病例和人禽流感病例，立即组织相关专业人员参照《深圳市预防和控制传染性非典型肺炎工作预案（卫生部分）》开展防治工作。本市医疗机构收治了SARS病例时，市疾控中心应及时登录“疾病监测信息报告管理系统”进行网络审核、上报。非典检测实验室和实验室人员须认真遵照卫生部发布的《传染性非典型肺炎实验室生物安全操作指南》、《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》，参照执行《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》的有关规定采集鼻拭子（或咽拭子）、含漱液、痰、血液（血清和EDTA抗凝血）、粪便、尿液等用于检测。标本采集的同时要注意对同一病例采集不同病程的标本，非典死亡病例，要做好尸体解剖和标本保藏及运送。如得到阳性结果时应及时将样本送广东省疾控中心实验室进行复核。
3、麻疹及风疹
（1）病例筛检：包括疑似病例、临床诊断病例、确诊病例和其它出疹病例。发热，出疹（全身性斑丘疹）并伴有咳嗽，卡他性鼻炎或结膜炎症状之一者，或被任何经过训练的卫生人员诊断为麻疹的病例均为疑似麻疹病例。临床诊断病例是指未进行流行病学调查或完成调查前失访或死亡的病例，实验室检测结果为阴性或无实验室诊断结果的临床报告病例，且与实验室确诊病例没有流行病联系。确诊病例包括实验室确诊病例和临床确诊病例，实验室确诊病例是指疑似麻疹病例有完整的流行病学调查资料，血清学诊断麻疹IgM抗体阳性；或从疑似麻疹病例的标本中分离到麻疹病毒，临床确诊病例是指疑似麻疹病例有完整的流行病学调查资料，标本检测结果为阴性或没有标本检测结果，且与实验室确诊麻疹病例有明显流行病学联系；或实验室排除其它出疹性疾病。其它出疹病例包括有完整的流行病学调查资料，采集了合格血标本，经合格实验室检测结果阴性；或经实验室证实为其它发热出疹性疾病；或无实验室诊断结果的临床报告病例，经流行病学调查，证实与其它实验室确诊病例无流行病学联系，并且能明确找出是由其它原因引起发热出疹的病例（如药物性过敏性皮疹等）。
（2）病原检索：建立市、区级的麻疹血清学实验室监测网络对所有疑似麻疹病例和疑似麻疹暴发进行血清学诊断与鉴别诊断，有计划地开展麻疹病毒学，麻疹疫苗效价，免疫成功率和人群抗体水平的监测；将麻疹疫情报告系统纳入到急性迟缓性麻痹（AFP）专报系统工作中，对所有麻疹病例进行报告；调查所有疑似麻疹病例，提高报告敏感性、完整性与及时性；开展暴发调查；分析人群免疫状况，发现高危地区和高危人群，预测并预防麻疹暴发。
4、军团病
（1）病例筛查
临床上军团菌感染有两种表现形式：肺炎型和庞蒂亚克热型（Pontiac fever）。
肺炎型：重型，潜伏期2～10 天，发病初期表现为低热、头痛、肌肉和关节疼痛、疲倦乏力、食欲差，持续1～2天后表现为高热（39～41℃）、干咳（或咳痰）、呼吸困难、气短、畏寒，偶有腹泻，X线片显示有肺炎征象。重症病人可发生肺外征象，可表现为肝功能损害及肾衰竭，尿中有蛋白和红细胞，有的甚至出现精神紊乱，有的还可引起亚急性心内膜炎、肺脓肿甚至肺空洞等。侵袭率约5%，可引起死亡，病程长，多为7～14天。
庞蒂亚克热型：轻型，潜伏期较短， 一般为1～3天，表现为发热、头痛、疲倦、食欲不振，肌痛、畏寒、恶心、干咳， 2～5天后自动缓解。大多无需治疗，侵袭率约90%，无死亡。早期最常见的胸部X线表现为一叶片状肺泡浸润阴影，有多变性、多形性、多发性的特点。当疾病进一步发展时，浸润阴影可增大或呈实变，并延至对侧。1/3患者有少量胸腔积液、胸膜增厚及肺脓肿表现；部分患者肺周围结节样可迅速增大；有些患者甚至可出现空洞，而空洞有形成快、闭合慢的特点。患者临床恢复后，肺部阴影还可持续几周。
（2）病原检索
应结合流行病学资料、临床表现和实验室结果进行综合分析。因军团菌肺炎临床表现与其他肺炎很难区分，因此主要结合实验室检验结果加以确诊。依据为从呼吸道分泌物和肺组织标本中培养分离到军团菌；免疫荧光镜直接观察到标本中的军团菌；检测病人尿标本中军团菌抗原；检测病人血清标本中的军团菌抗体滴度，急性期和恢复期血清抗体滴度4倍增长或单份血清抗体滴度≥1：256。依据以上实验室数据，结合临床X线检查及相关表现加以确诊。临床标本（痰液、气管内吸取物、支气管镜洗液、胸水或肺组织匀浆）培养和分离出军团菌是特异和可信的军团病诊断方法。
5、水痘
（1）病例筛查：水痘是有水痘-带状疱疹病毒引起的急性呼吸道传染病，传染性很强，主要发生在儿童，其特点是全身皮肤分批出现散在的斑疹、丘疹和水疱疹。水痘一般经空气飞沫、密切接触传播，人对水痘普遍易感。水痘的诊断，根据接触史、特征性皮疹和瘙痒等症状临床上不难诊断。
（2）暴发疫情监测： 各级医疗卫生机构和企事业单位、学校、托幼机构医疗卫生保健人员发现短时间内出现异常增多的水痘病例时，辖区疾病预防控制中心组织开展当地流行病学调查及处理，采集鼻咽拭子或咽漱液、疱疹分泌液及采集血清，进行实验室快速诊断检测（如PCR、胶体金、ELISA等技术）以及病毒分离培养，完成调查报告，必要时市疾病预防控制中心参与调查处理。
6、其它常见呼吸道病毒监测
（1）病例筛选
参照流感样病例的病例筛选，对流感样病例（ILI）监测中鉴定为流感阴性的样本，进行其它常见呼吸道病毒检测。
（2）病例检索
采集患者的鼻咽拭子或咽漱液、双份血清；同一患者尽可能采集双份标本，一份为鼻咽拭子用于常见呼吸道病毒的抗原检测，一份为双份血清用于常见呼吸道病毒的抗体检测。采集的鼻咽拭子、血清标本要立即放在4～8℃条件下保存，并在24小时内送至辖区疾病预防控制中心检测。
各区疾病预防控制中心对监测医院送检的鼻咽拭子或咽漱液标本在48小时内利用荧光定量PCR的方法进行冠状病毒（229E，OC43，NL63，HKU1亚型）、副流感病毒（1，2，3，4型）、呼吸道合胞病毒（A，B亚型）、间质肺病毒（A，B亚型）、鼻病毒（A，B，C亚型）、腺病毒等多种呼吸道病原体的检测，阳性样本送市疾病预防控制中心，不能及时检测应放置-70℃保存。 经费总需求
（一）经费需求
项目所需的运行经费主要包括如下六大部分：流感样病例的流行病学监测、流感病毒的病原体分离培养、流感样病例暴发疫情的快速检测和病原体培养、一般人群和职业人群的血清抗体检测、流感病毒分子生物学监测、应急监测、检查督导和其他；人禽流感病例的快速检测和应急物资储备；SARS疑似病例的快速检测与应急物资储备；不明原因肺炎病毒性病原体的快速检测；风疹、麻疹监测网络运行与相关病例检测；军团病病原体检测。
（二）测算方法原则，根据项目工作总量及其各级各监测点的职责和任务分工，在不考虑工资和福利补贴等人员费用的情况下，仅对项目运行费用进行测算和分配。
测算的基本方法：依据我市2006-2009年流感、人禽流感等重大呼吸道传染病的监测结果（见下表），量化工作指标，同时结合2006-2009年实际经费的使用情况，并以此作为测算的主要依据。
表1 深圳市2006-2009年流感监测情况及本项目监测任务数
年份 | 监测内容 | 市CDC | 罗湖 | 福田 | 南山 | 宝安 | 龙岗 | 盐田 | 光明 | 合计 |
2006 | 流感样病例检测数 | 1074 | 258 | 311 | 274 | 243 | 463 | 265 |
| 2888 |
暴发疫情起数 |
| 36 | 18 | 18 | 12 | 22 | 7 |
| 113 | |
一般人群血清抗体检测数 |
| 200 | 200 | 200 | 100 | 100 | 193 |
| 993 | |
职业人群血清抗体检测数 |
|
|
|
|
|
|
|
| 587 | |
肺炎标本检测数 | 245 |
|
|
|
|
|
|
| 245 | |
麻风疹血清抗体检测数 |
| 295 | 222 | 506 | 1392 | 1172 | 48 |
| 3635 | |
小计 | 1319 | 789 | 751 | 998 | 1747 | 1757 | 513 |
| 8461 | |
2007 | 流感样病例检测数 | 1071 | 233 | 269 | 240 | 178 | 269 | 245 |
| 2505 |
暴发疫情起数 |
| 9 | 18 | 13 | 5 | 5 | 0 |
| 50 | |
一般人群血清抗体检测数 |
| 299 | 300 | 300 | 300 | 296 | 205 |
| 1700 | |
职业人群血清抗体检测数 |
| 45 | 61 | 45 | 48 | 60 | 32 |
| 291 | |
肺炎标本检测数 | 280 |
|
|
|
|
|
|
| 280 | |
麻风疹血清抗体检测数 |
| 378 | 314 | 992 | 3273 | 1774 | 44 |
| 6775 | |
小计 | 1351 | 964 | 962 | 1590 | 3804 | 2404 | 526 |
| 11601 | |
2008 | 流感样病例检测数 | 1072 | 288 | 305 | 263 | 351 | 481 | 291 | 146 | 3197 |
暴发疫情起数 |
| 16 | 15 | 25 | 6 | 9 | 2 |
| 73 | |
一般人群血清抗体检测数 |
| 300 | 285 | 295 | 300 | 300 | 733 |
| 2213 | |
职业人群血清抗体检测数 |
| 124 | 96 | 83 | 96 | 97 | 79 |
| 575 | |
肺炎标本检测数 | 320 |
|
|
|
|
|
|
| 320 | |
麻风疹血清抗体检测数 |
| 1023 | 345 | 454 | 2579 | 1292 | 22 | 17 | 5732 | |
小计 | 1392 | 1751 | 1046 | 1120 | 3332 | 2179 | 1127 | 163 | 12110 | |
2009 | 流感样病例检测数 | 1687 | 457 | 481 | 538 | 449 | 569 | 498 | 465 | 5144 |
暴发疫情起数 |
| 86 | 64 | 98 | 39 | 113 | 14 |
| 414 | |
一般人群血清抗体检测数 |
| 298 | 156 | 150 | 300 | 120 | 384 | 150 | 1558 | |
职业人群血清抗体检测数 |
| 30 | 30 | 30 | 50 | 50 | 10 |
| 200 | |
肺炎标本检测数 | 380 |
|
|
|
|
|
|
| 380 | |
麻风疹血清抗体检测数 |
| 689 | 115 | 102 | 940 | 236 | 6 |
| 2088 | |
小计 | 2067 | 1560 | 846 | 918 | 1778 | 1088 | 912 | 615 | 9784 |
本项目所需经费由市、区财政部门和市、区卫生部门纳入年度经费预算。
本项目的经费承担是根据市、区各自承担的业务含量、职责以及工作内容，结合人员分布的百分数来综合预算。全市目前总人口数接近1450万人。其中宝安区占39.02％，龙岗区占24.47％，福田区占12.98、罗湖区占11.05％，南山区占10.31％，盐田区占2.17％。
试剂费用：全市流感局部暴发使用的荧光PCR检测试剂盒，A、B流感抗原检测试剂盒（胶体金法）试剂，不明原因病毒性肺炎病原体荧光PCR检测试剂盒由市疾病预防控制中心根据性价比负责集中招标采购统一配发，由各区项目办根据辖区工作的实际需要每月向市疾病预防控制中心申领一次。试剂采购费用由市项目办承担。其它经费按项目经费承担表执行。
项目费用测算方法见附件。 经费管理
按照政府事业单位项目经费管理方法运行。 督导与考核
（一）市、区卫生行政部门负责对《深圳市流感、人禽流感等重大呼吸道传染病监测项目》工作进行监督管理，对全市和各辖区的监测医院、疾病预防控制机构、社区健康服务中心、学校和家禽场等的相关工作进行经常性的监督；当流感、人禽流感等重大呼吸道传染病暴发或流行时，依法定期进行常规监测工作、疫情调查处理工作的检查和督导。
（二）常规督导：区级疾病预防控制中心每半年一次对辖区内的监测单位进行督导，包括监测所涉及的各项内容。
（三）专项督导：市疾病预防控制中心在接到上级指示时、或发现监测系统出现异常时，临时开展专项督导。如，流感样病例标本的采集、流感病毒标本的运输与保藏和流感病毒实验室分离与鉴定。
（四）考核：市卫生行政部门组织市、区疾病预防控制中心每年联合开展1次全市范围的流感及人禽流感监测工作考核，考核时间为12月至次年1月期间。 质量控制
按照《深圳市疾病预防控制工作规范》中流感及人禽流感传染病预防与控制内容和《全国流感监测方案（2010年版）》、《广东省流感监测方案（2010年版）》要求，深圳市流感及人禽流感防制工作检查标准见附件。 1、项目费用测算方法
2、禽流感职业暴露人员防护指导原则指引
3、流感标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输指引
4、流感病毒培养分离技术指引
5、流感病毒鉴定技术指引
6、流感爆发疫情样本指引
7、流感实验室检测工作指引
8、人禽流感病例流行病学调查指引
附表1 医院/社康中心/学校/家禽养殖场流感样病例原始登记表
附表2-1 市（区） 医院流感样病人采样送检表
附表2-2 市（区） 医院住院肺炎病人采样送检表
附表3-1 市（区）监测医院/医务室/社康中心流感样病例数及监测门诊病例总数周报表
附表3-2 家禽养殖场流感样病例数及缺勤工人总数统计周报表
附表3-3 家禽养殖场流感样病例、肺炎病例个案记录表
附表4-1 流感病毒鸡胚分离实验记录
附表4-2 流感病毒MDCK细胞分离实验记录
附表5 市（区）流感毒株送检单
附表6 市（区） 年 月_____ 医院流感病毒分离情况月统计表
附表7 流行性感冒个案调查表
附表8 流行性感冒病例调查一览表
附表9 流感及流感样病例暴发疫情监测报告表
附表10 深圳市、区流感监测单位工作考核评估标准
附件1
项目费用测算方法
流行病学调查与样品采集（93.44万元）开展流感、人禽流感等重大呼吸道传染病现场流行病学调查和重点场所高危人群的评估工作，为疫情的评估和控制提供重要的科学依据。主要经费用途如下：
（一）流感样病例统计
1、监测哨点医院呼吸道疾病病例统计：每天登记内科、儿科、急儿、急内以及发热门诊就诊的流感样病例，并统计每天就诊的流感样病例数和该监测门诊就诊病例总数。该项工作需要一人每天花费约2小时的工作时间， 每周约需两个工作日时间；按每个工作日补助100元/人标准给予补助，每个月一所医院约需800元，9所医院共需8.6万/年。
2、社康中心呼吸道疾病病例统计：每天登记内科、儿科、急儿、急内以及发热门诊就诊的流感样病例，并统计每天就诊的流感样病例数和该监测门诊就诊病例总数。该项工作需要一人每天花费约1小时的工作时间， 每周约需一个工作日时间； 按每个工作日补助100元/人标准给予补助，每个月一所社康中心约需400元，8所社康共需3.84万/年。
3、学校呼吸道疾病病例统计：每日收集就诊流感样病例数及就诊内科病例总数。该项工作需要一人每天花费约1小时的工作时间， 每周约需一个工作日时间；按每个工作日补助100元/人标准给予补助，每个月一所学校约需400元，3所学校共需1.44万/年。
4、家禽饲养场及批发市场呼吸道疾病病例统计：每日统计流感样病例、肺炎病例数及缺勤工人总数， 该项工作需要一人每天花费约0.5小时的工作时间， 每周约需半个工作日时间；按每个工作日补助100元/人标准给予补助，每个月一所家禽饲养场约需200元，4所家禽饲养场共需0.96万/年。
（二）现场流行病学调查：开展流感及人禽流感、SARS和其他不明原因呼吸道疾病暴发疫情调查处理，参与人员包括流行病、实验室、消毒等相关人员，每起疫情约需参与人员10人次。按100元/天/人标准给予补助，按每年发生450起计算，共需45万。
（三）采样人员劳务费：流感样病例咽拭标本约3000份（市级1000；区级2000），住院肺炎病例咽拭标本400份、血清标本400份，局部暴发疫情咽拭标本约1000份，按20元/份标准给予补助，需9.6万元；一般人群、职业人群的流感、禽流感血清抗体水平监测评估每年约3000份，按10元/份标准给予补助，需3万元；共需12.6万。
（四）被采样禽类从业人员补助：按每人每次100元计算， 共需6万元。（五）数据和资料规整统计：国家、省、市、区已实行流感信息、数据和报表网络直报系统；并逐步完善市流感及人禽流感等重大呼吸道传染病监测信息网络平台，动态监测全市流感及人禽流感等重大呼吸道传染病的活动情况。该监测网络维护费用共需15万/年。
流行病学调查与样品采集工作经费需求表
| 哨点类型 | 单位成本 | 哨点数 | 金额 |
流感样病例 统计 | 哨点医院 | 800元/月 | 9 | 8.6万/年 |
社康中心 | 400元/月 | 8 | 3.84万/年 | |
学校 | 400元/月 | 3 | 1.44万/年 | |
家禽饲养场 | 200元/月 | 4 | 0.96万/年 | |
| ||||
|
| 单位成本 | 疫情起数 | 金额 |
现场流行病学调查 |
| 100元/天/人 | 450起 | 45万 |
| ||||
| 标本类型 | 单位成本 | 标本份数 | 金额 |
采样人员 劳务费 | 流感样病例咽拭标本 | 20元/份 | 3000 | 6万 |
住院肺炎病例咽拭标本 | 20元/份 | 400 | 0.8万 | |
血清标本 | 20元/份 | 400 | 0.8万 | |
局部暴发疫情咽拭标本 | 20元/份 | 1000 | 2万 | |
一般、职业人群血清抗体 | 10元/份 | 3000 | 3万 | |
被采样禽类从业人员补助 |
| 100元/人/次 |
| 6万 |
| ||||
数据和资料 规整统计 |
|
|
| 15万 |
合 计 | 93.44万 | |||
（一）试剂费用（322.4万元）
1、病毒分离和鉴定费
按每年流感样病例咽拭标本约3000份（市级1000；区级2000）和局部暴发疫情咽拭标本约1600份（此数按2006年1－7月份744份测算）， 每一份标本所使用的耗材为：鸡胚、细胞（MDCK、LLC、Hep－2等）、红血球、鉴定标准血清、细胞培养液等。每份标本40元。共需18.4万元。
住院肺炎病例咽拭标本约400份，每一份标本所使用的耗材如：鸡胚、细胞（MDCK、LLC、Hep－2等）、红血球、鉴定标准血清（包括流感、禽流感、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒）、细胞培养液等。每份标本100元。共需4万元。（要培养多种病毒，选用3－4种细胞根据上表折算100元/份）
2、血清抗体检测
每年住院肺炎病例血清标本约400份，检测项目包括流感、禽流感、副流感病毒、合胞病毒、腺病毒的抗体，每份标本所需检测试剂盒等费用约250元，总计10万元；一般人群、职业人群的流感、禽流感血清抗体水平监测评估每年约3000份，每一份标本所使用的试剂如：检测试剂盒、免疫荧光试剂及鉴定标准抗原等。每份标本20元，折算费用约6万元；SARS血清标本200份，每份标本50元，折算费用月1万元；风疹、麻疹血清抗体检测1000份，每份标本30元，折算费用3万元。共需20万元。
3、快速诊断
常规监测标本约3000份和局部暴发疫情咽拭标本约1600份，需要进行荧光定量PCR快速检测。每份标本所需检测试剂盒如：RNA提取试剂盒、流感荧光定量RT-PCR快速检测盒A＋B、H5亚型、A、B流感抗原检测试剂盒（胶体金法）、A、B流感IgM血清抗体（ELISA法）；SARS荧光定量RT-PCR检测试剂盒、不明原因肺炎病毒性病原体荧光定量RT-PCR试剂盒等，每份标本约需500元。共需230万元。
4、抗原性分析及预测预警
开展流感及人禽流感病毒的基因分析、功能蛋白分析，对流感及人禽流感的发生流行进行预测预警，共需50万元。
（二）一次性耗材费（30万元）
包括采血管、采血针、医用棉签、手套、口罩、细胞培养瓶、细胞培养管、刻度吸管、滴管、保种管、离心管、个人防护和消毒用品等等，按30元/人份（1万份/年）共需30万元。
实验室试剂和耗材工作经费需求表
| 标本类型 | 单位成本 | 标本份数 | 金额 |
病毒分离和鉴定 | 流感样病例咽拭标本 | 40元/份 | 3000 | 12万 |
住院肺炎病例咽拭标本 | 100元/份 | 400 | 4万 | |
局部暴发疫情咽拭标本 | 40元/份 | 1600 | 6.4万 | |
| ||||
血清抗体 | 住院肺炎病例血清标本 | 250元/份 | 400 | 10万 |
一般、职业人群血清抗体 | 20元/份 | 3000 | 6万 | |
SARS血清标本 | 50元/份 | 200 | 1万 | |
麻疹风疹血清标本 | 30元/份 | 1000 | 3万 | |
| ||||
快速检测 | 流感样病例咽拭标本 | 500元/份 | 3000 | 150万 |
局部暴发疫情咽拭标本 | 500元/份 | 1600 | 80万 | |
| ||||
抗原性分析及预测预警 |
|
|
| 50万 |
一次性耗材费 |
|
|
| 30万 |
| ||||
合 计 | 352.4万 | |||
（一）监测网络培训费
每年召开两次流感及人禽流感等重大传染病监测工作总结会议；举办全市相关技术人员实验室检测技术、流行病学调查、消杀技术培训班各1次，培训人员共计200人次。共需20.6万元。
经费测算如下：
1） 餐费：早餐20元及人，中、晚餐各50元/人，120元/人/天×200人＝24000元；
2） 会场租用费：6000元/天；
3） 住宿费：110人/天×200人＝22000元；
上述三项合计费用为52000元/天×3天＝156000元；
4） 每次拟邀请两名国家级专家进行授课，往返路费、住宿费、餐费、讲课费按5000元/人计，则费用为5000元及人×2人×3次＝30000元；
5） 资料费用为：按每人50元计算，10000元；
6） 其他费用支出：10000元；
（二）项目督导、考核与评价工作经费
项目考核及技术指导，流感监测各项工作；工作例会，流感各项工作交流；奖励，1、毒株分离奖励费2、全市流感监测单位及专业人员。共需9.2万元。
（三）业务进修经费
每年安排8名专业人员外出进修学习，每人每次费用约为1万元， 共需8万元。共需8万元。 物质储备经费（50万元）
主要用于突发重大疫情个人防护设备及应急保障试剂、预防性药品、消毒设备及药品等经费。共需50万元。 奖励费用（9万元）
监测医院采集上送的流感样病例标本分离培养出流感病毒，每株奖励人民币40元（实验人员20元、采样人员20元）。1500×40＝60000元；其它常见呼吸道病毒检测，PCR鉴定出一份阳性样本奖励人民币20元。500×20＝10000元。培养分离出一株毒株奖励人民币100元。100×100＝10000元；每季度根据各区的麻疹、风疹IgM实际检测项次，以区为单位进行经费补贴，补贴标准为10元/项次。1000×10＝10000元。共需9万元。 其它（75.58 万元）
人员聘用、交通费、车辆使用费、差旅费、文印费、通信费、装订费、办公用品等。
（一）人员聘用：
市疾控中心每年聘请本科和硕士毕业专业技术人员各1人、每个区疾控中心聘请1本科毕业专业技术人员，从事流感病原学和分之生物学检测和研究工作；按本科生2000元/月、研究生2400元/月支付工资。共需19.68万元。
（二）交通费、车辆使用费：
市、区疾控中心用车费用预算，具体内容如下：
1、用车内容及里程：坑梓取鸡胚90公里/月，总计2160公里/年；标本运送及疫情处理3000公里/年；工作会议、项目督导及网络维护3000公里/年。项目运行全年用车总里程约为10000公里；
2、全年用油量：按耗油量14升/100公里计算，项目运行总油费约8000元/年；
3、过路费、洗车费、停车费等2000元/年；
4、维修保养费 6000元/年；
5、保险费 8000元/年；
以上费用合计：23546元，7个单位共需16.5万元。
（三）差旅费：
全市项目人员共51人，按每次每年参加一次国家或省、市的会议研讨培训、每人次费用4000元及计算，共需20.4万元。
（四）文印费、通信费、装订费、办公用品等：共需19万元。
深圳市流感项目市级管理费用表
| 经费项目 | 数量 | 成本 | 小计 | 备注 |
（三） | 会议、培训 | 5 | － | 20.6 | 1年主办培训班、工作会议约5次 |
督导考核 | － | － | 9.2 |
| |
业务进修费 | 8 | 1 | 8 | 每年8名人员进修 | |
（四） | 物资储备经费 | － | － | 50 |
|
（五） | 人员聘请 | 8 | 2.46/年 | 19.68 | 以聘用8人计 |
差旅费 | 51人次 | 4000/年 | 20.4 | 市级专业人员 | |
文印等办公 | － | － | 19 |
| |
车辆使用费 | 7 | 2.3 | 16.5 | 按7个单位计算 | |
（六） | 奖励费用 | － | － | 9 | 包括流感毒株奖励等 |
| 合计 | － | － | 172.38 | － |
注：此表为（三）～（六）之费用
项目 | 经费（万） |
流行病学调查与样品采集 | 93.44 |
实验室试剂和耗材 | 352.4 |
学术交流及培训 | 37.8 |
物质储备经费 | 50 |
其它 | 75.58 |
奖励费用 | 9 |
合计 | 618.22 |
附件2
禽流感职业暴露人员防护指导原则指引
防护用品禽流感职业暴露人员使用的防护用品应符合国家的有关标准。
（1）防护服：一次性使用的防护服应符合《医用一次性防护服技术要求》GB19082-2003。
（2）防护口罩：应符合《医用防护口罩技术要求》GB19083-2003。
（3）防护眼镜：视野宽阔，透亮度好，有较好的防溅性能，弹力带佩戴。
（4）手套：医用一次性乳胶手套或橡胶手套。
（5）鞋套：为防水、防污染鞋套。
（6）长筒胶鞋。
（7）医用工作服。
（8）医用工作帽。 防护用品的穿脱顺序
A.穿戴防护用品顺序
步骤1 戴口罩，一只手托着口罩，扣于面部适当的部位，另一只手将口罩带戴在合适的部位，压紧鼻夹，紧贴手鼻梁处。在此过程中，双手不接触面部任何部位。
步骤2 戴帽子，戴帽子时，注意双手不接触面部。
步骤3 穿防护服。
步骤4 戴上防护眼镜，注意双手不接触面部。
步骤5 套上鞋套。
步骤6 戴上手套，将手套套在防护服袖口外面。
B.脱掉防护用品顺序
步骤1 摘下防护镜
步骤2 脱掉防护服，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。
步骤3 摘掉手套，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。
步骤4 将手指反掏进帽子，将帽子轻轻在下，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。
步骤5 脱下鞋套，将反面朝外，放入黄色塑料袋中。
步骤6 摘掉口罩，一手按住口罩，另一只手将口罩带摘下，注意双手不接触面部。 分级防护原则
各级医务人员、疾病预防控制机构及其他有关人员在医院或疫点、疫区进行禽流感防治工作时，应遵循以下防护原则：
（1）一级防护
A.适用范围
①对禽流感疑似或确诊病例的密切接触者及病死禽的密切接触者进行医学观察和流行病学调查的人员。
②对疫点周围3公里范围内（疫点除外）的家禽进行捕杀和无害化处理及对禽舍和其它场所进行预防性消毒的人员。
B.防护要求
①戴16层棉纱口罩（使用四小时后，消毒更换），穿工作服，戴工作帽和乳胶手套。
②对疫点周围3公里范围内的家禽宰杀和无害化处理，进行预防性消毒的人员还应戴防护眼镜、穿长筒胶鞋、带橡胶手套 。
③每次实施防治处理后，应立即进行手清洗和消毒。
（2）二级防护
A.适用范围
①进入医院污染区的人员；采集疑似病例、确诊病例咽拭子的人员；处理其分泌物、排泄物的人员；处理病人使用过的物品和死亡病人尸体的人员以及转运病人的医务人员和司机。
②对禽流感疑似或确诊病例进行流行病学调查的人员。
③在疫点内对禽流感染疫动物进行标本采集、捕杀和无害化处理以及进行终末消毒的人员。
B.防护要求
①穿普通工作服、戴工作帽、外罩一层防护服、戴防护眼镜和防护口罩（离开污染区后更换），戴乳胶手套、穿鞋套。进行家禽的宰杀和处理时，应戴橡胶手套，穿长筒胶鞋。
②每次实施防治处理后应立即进行手清洗和消毒，方法同一级防护。
（3）三级防护
A.适用范围
确定禽流感可由人传染人时，对病人实施近距离治疗操作例如气管插管、气管切开的医务人员。
B.防护要求
除按二级防护要求外，将口罩、防护眼镜换为全面型呼吸防护器（符合N95或FFP2级标准的滤料）。 对手清洗和消毒的要求和方法
（1）对洗手的要求
A.接触确诊禽流感病人和疑似病人后。
B.接触血液、体液、排泄物、分泌物和被污染的物品后。
C.进入和离开隔离病房穿戴防护用品前、脱掉防护用品后。
D.在同一病人身上，从污染操作转为清洁操作之间。
E．戴手套之前，摘手套之后。
（2）对手消毒的要求
A.接触每例确诊禽流感病人和疑似病人之后。
B.接触感染的伤口和血液、体液、排泄物和分泌物之后。
C.离开隔离病房、ICU等污染区域脱掉防护用品后。
D.接触被禽流感病毒污染的物品之后。
（3）标准洗手方法
（ⅰ）掌心对掌心搓擦；
（ⅱ）手指交错掌心对手背搓擦
（ⅲ）手指交错掌心对掌心搓擦
（ⅳ）两手互握互搓指背
（ⅵ）拇指在掌中转动搓擦
（ⅶ）指尖在掌心中搓擦
（4）手消毒的方法
手消毒可用0.3-0.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂（异丙醇类、洗必泰-醇、新洁尔灭-醇、75%酒精等消毒剂）揉搓作用1-3分钟。
附件3
流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输指引
流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
采样液常用的采样液有以下五种：普通肉汤、pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml，和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml，-20℃冻存。采样方法有以下几种：
1） 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
2） 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3） 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。
4） 漱口液：用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液
5） 鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。 临床标本运送
新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。
冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离的标本应置-70℃或以下保存。
临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。 临床标本处理
临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。
鼻咽漱液或抽取液：用干净灭菌过的毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。
注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同上前，混匀后置4℃ 过夜或室温作用数小时后可接种。
临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离阳性的标本－70℃保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安全的有关规定处理。 血清标本的采集与处理
血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断及人禽流感待查病例的诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本时同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2～4周采集。一般采集空腹血。单份血清不能用作诊断。
取一根至少能装3 ml以上，干净和灭过菌的血清管做好标记，并进行登记，登记的内容包括：医院名称，患者姓名，性别，急性期（Acute，A）或是恢复期（Convalescence，C），采样日期（年，月，日）。
1． 从患者手臂静脉采2 ml血，放入准备好的上述血清管中。
2． 然后置室温数小时待血完全凝固。
3． 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于1.5 ml 无菌管中，做好标记。
4． 血清可置4℃存放一周，存放超过一周需置-20℃或以下保存。 流感病毒株的运输
需送国家流感中心实验室检测的病毒分离物，填写“流感/人禽流感毒株送检单”，在冻存后，在低温条件下，送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核，运输时遵守国家生物安全的有关规定。
1．流感毒株的送检要求
（1）自国家级流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的全部毒株。
（2）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，单向血凝抑制效价与国家流感中心提供的标准参照血清相比，有4倍或4倍以上差异的毒株。
（3）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA＜8，且网络实验室不具备RT-PCR鉴定能力。
（4）暴发时采样分离到的所有流感毒株。
（5）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株。
（6）所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。
（7）全国流感监测网络实验室直接将毒株送至国家流感中心，填写“流感/人禽流感毒株送检单”。监测网络实验室中的市级实验室送检毒株时，应同时送省级疾控中心实验室备份。
（8）送检毒株在HI试验完成后，每两周送至国家流感中心。
（9）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株，应在HI试验完成后24小时内送至国家流感中心。
2．寄送流感中心的流感毒株标本的包装、运输
（1）病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本。
（2）将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封。
（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填在“流感/人禽流感毒株送检单”内，送检单应单独放在防水的袋子里。
（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。
（5）标本运输：异地运输可以采用邮寄或快递的方法 标本的接收
送检的标本（毒株）送到实验室后，由专人在生物安全柜内打开标本的包装。记录收到日期、送检实验室名称、核对并记录送检标本（毒株）标编号是否与送检单相同。收到的毒株后，给送检单位及时反馈。
附件4
流感病毒培养分离技术指引
病毒分离是流感诊断的金标准，也是流感病原学监测的基础。目前，常用鸡胚和MDCK（狗肾细胞）分离培养流感病毒。 流感病毒鸡胚分离标准操作规程
1.试验材料：
（1）9～11日龄鸡胚
（2）照卵灯
（3）70%～75％酒精
（4）一次性注射器
（5）鸡蛋开孔器
（6）蜡或胶水
（7）10ml 试管和试管架
（8）1、2、5、10ml 移液管
（9）无菌镊子
2.流感病毒鸡胚分离程序
所有有关病毒分离的操作都应在生物安全Ⅱ实验室生物安全柜中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全Ⅱ实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。
（1）验卵
1） 用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置；
2） 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉；
3） 如何判断鸡胚状态
血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块
胎动：活胚有明显的自然运动，但是大于14天的胎动则不明显；死胚无胎动
绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。
（2）鸡胚接种
1） 将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚；
2） 用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm裂口，每份标本接种3个鸡胚；
3） 用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头；
4） 从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100µl临床标本。将针头退出至½ 寸，将另外100 µl临床标本注入鸡胚尿囊腔；
5） 用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚；
6） 将针头弃于合适的生物安全装置中；
7） 用消毒过的医用胶布封口；
8） 33～35℃ 温箱培养鸡胚2～3 天。A型流感病毒培养2天，B型流感病毒培养3天，临床采样标本通常培养3天；鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去；
提示：禽流感需35ºC 或 37℃培养，哺乳动物流感病毒35℃培养（禽流感在35ºC时也会生长良好！）
（3）鸡胚尿囊液和羊水的收获
1） 鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时；
2）标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部；
3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜，用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中；用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中，羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并；
4）将鸡胚收获液3000rpm离心5分钟去除血液和细胞，进行红细胞凝集试验（具体方法参见流感病毒的鉴定技术中的HA试验部分），HA≥8 的进行病毒的鉴定；如没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚传代1次（对于“O”相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）；传代后HA滴度仍为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理；对于HA≤8 的鸡胚分离物继续进行鸡胚传代，直至HA≥8 时再进行病毒的鉴定；经连续传代后HA＜8，可以用RT-PCR方法鉴定分型；
5）对于HA≥8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-1…10-3稀释，具体的稀释浓度与HA滴度的大小有关，一般滴度小于32时选择10-1稀释度接种；滴度大于32以上时选择10-2或10-3稀释度接种。
（四）注意事项
1．不要在-20℃条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳定；
2．流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒；禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。 MDCK细胞培养技术
（一）生物安全级别和生物安全规定
1．MDCK细胞培养实验室生物安全级别：生物安全一级或以上；
2．实验室生物安全规定
遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。
（二）细胞培养的所需材料：
1．生长成片的MDCK细胞；
2．T-75细胞培养瓶， 颈口有倾角；
3．D-MEM培养液；
4．青、链霉素母液（10，000 U/ml 青霉素 G；10，000 µg/ml 硫酸链霉素），分装后保存于-20 ℃；
5．HEPES 缓冲液， 1 M 母液；
6．胎牛血清，40 nm滤过；
7．EDTA-胰酶 （0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na），分装后保存于-20 ℃；
8．牛血清白蛋白组分V， 7.5%溶液；
9．1ml 、10ml无菌移液管；
10．70％～75％的酒精；
建议：要求经常检查试剂使用的有效期。
（三）培养基和试剂的准备
1. 含L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液的准备（用于MDCK培养）：
500 ml D-MEM液中加入：
青、链霉素母液5 ml （终浓度达： 100 U/ml 青霉素and 100 µg/ml 链霉素）
HEPES缓冲液12.5 ml （终浓度： 25 mM）
7.5%牛血清白蛋白组分V 12.5 ml ；
2. 细胞生长液
胎牛血清5 ml 加到 95 ml 的完全型D-MEM液使胎牛血清的终浓度为5%。
注：此处采用进口特级胎牛血清，因此牛血清的终浓度选则5％。
3. MDCK细胞的培养程序
这里以T-75细胞瓶单层培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA－胰酶等，37 ℃回温后，用70％～75％酒精擦拭后放于生物安全柜内。
（1）弃培养液，加5 ml预先37℃温浴的EDTA-胰酶；
（2）温和地摇动细胞瓶1分钟，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；
（3）重新加入5 ml预先37℃温浴的EDTA-胰酶重复上述步骤；
（4）加1 mlEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料表面分离（约5～10分钟）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1ml牛血清灭活残余的胰酶；
（4）加9 ml完全型D-MEM，轻轻上下移动移液管来分散细胞团；
（5）取10 ml混合物加到90 ml 细胞生长液，该培养液含终浓度为5%的胎牛血清。（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）；
（6）每个T-25细胞培养瓶加6 ml （600，000 细胞）悬液，剩余的细胞悬液可加到T-75细胞瓶用于细胞传代；通常6 ml细胞悬液数日可长成成片生长的细胞；
（7）于37℃培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。
注：消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25%胰酶与Versene 按照1：7的比例配成消化液使用。
每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度，此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。
（四）细胞的冻存
1．细胞冻存材料：
（1）成片的MDCK细胞：细胞生长良好存活率高，80％～90％成片。
（2）二甲基亚砜（DMSO）
（3）胎牛血清
（4）EDTA-胰酶 （0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA. 4Na）
（5）移液管：1ml，10ml
2. 细胞冻存步骤
（1）冻存液的配置：
胎牛血清：9ml
二甲基亚砜：1ml
（2）细胞消化，消化过程同细胞培养的消化。
（3）细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。
细胞冻存浓度为1×106
（4）细胞冻存过程：4℃ 2小时，-20℃ 2小时，放入液氮长期保存。
（五）细胞的复苏：
冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。细胞活化后，需要数日或继续传代一至二代，其细胞生长或细胞特性表现才会恢复正常。
1．材料：
（1）37OC恒温水浴箱
（2）细胞生长液 完全型D-MEM 9ml
胎牛血清 1ml
（3）T-25培养瓶， 无菌移液管
（4）70％～75％的酒精
2.细胞复苏步骤：
（1）将细胞生长液放入37℃回温，回温后以70％～75％的酒精擦拭，放入生物安全柜（无菌的操作台）内。
（2）自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉。
（3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1分钟内全部融化，以70％～75％的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜（无菌操作台）。
（4）取出1.0ml解冻的细胞悬液，缓慢加入有生长液的细胞培养瓶内，混合均匀，放入培养箱培养。
（5）次日，更换细胞生长液。
（六）质量控制
在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代次的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传15～20代，达到40代以上时，在间隔期可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。
（七）MDCK细胞系的敏感性的检测
选择已知滴度的阳性质控流感病毒，做10－1……10－5稀释，取0.5ml分别感染早代的细胞株和现有的细胞株。3～5天后收获病毒液，检测早代细胞株与现有细胞株培养的病毒液间是否由差别。如有明显差别，表明现有细胞株敏感性已经下降，应重新复苏新的细胞株。
附件5
流感病毒鉴定技术指引
血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验流感病毒的血凝素（HA）能够引起红细胞凝集，因此而得名。用于检测流感病毒滴度的红细胞凝集试验也是根据病毒的这一特性而建立的。当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则可以抑制红细胞凝集的出现。即为红细胞凝集抑制实验（HAI）的理论根据。
微量红细胞凝集抑制实验是目前最常用的一种鉴定流感病毒的方法。该方法简单、易行、结果可信。用于HAI的标准参照血清必须及时更新，最好包括当时的疫苗株和流行代表株。HAI中所用的血清必须经特殊处理以清除非特异性抑制素。
（一）生物安全要求
生物安全要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。
（二）实验材料
1．国家流感中心提供的A（H1N1）、A（H3N2）、B型流感病毒的标准参照抗原与血清；
2．缓冲液和其他试剂：
（1）红细胞悬液（鸡、豚鼠、或人“O”型红细胞）
（2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M， PH7.2
（3）生理盐水
（4）其他：
37℃水浴
56℃水浴
台式离心机
多道可调加样器
离心管
无菌纱布
96孔微量板：鸡红细胞选择：“V”型底微量板；豚鼠和人“O”型红细胞选择“U”型底微量板
（三）试剂配制
1．磷酸缓冲液（PBS），0.01M， PH7.2
25×倍 PBS缓冲液：2.74g Na2HPO4，0.79g NaH2PO4 加去离子水至100 ml；
2．工作液配制：25倍PBS缓冲液完全溶解后，取 40ml 25倍 PBS液，加入8.5g NaCl，加去离子至1000 ml。用1N NaOH 或1N HCl调整PH 至7.2。121℃高压灭菌15分钟，消毒后至4℃保存，保存期为3周；
3．生理盐水： 0.85% NaCl
20×母液：170g NaCl加入1000ml去离子水，高压灭菌，生理盐水（0.85%）： 20×母液50ml加入去离子水950ml，121℃高压灭菌15分钟，消毒后至4℃保存，保存期为3周；
4．阿氏液配制：
25 g葡萄糖
8.5 g柠檬酸钠
4.5 g NaCl
0.55 g柠檬酸
加去离子水1000ml，用1N NaOH 或1N HCl调整PH 至6.1，用0.22μm的细菌滤器过滤。
（四）红细胞悬液配制
1．取阿氏液中的红细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清；
2．加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200rpm离心5分钟，弃上清；
3．PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后，1200rpm离心10分钟；
4．将红细胞稀释至合适的浓度。火鸡、鸡的红细胞，实验终浓度一般0.5%，如用人“O”型、豚鼠红细胞，终浓度为0.75%。
（五）实验步骤
1．RDE（受体破坏酶）处理标准参照血清
（1）1份血清加入4份RDE ，混合；
（2）37℃水浴过夜；
（3）56℃水浴加热30分钟，灭活RDE。
表1 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞 | 鸡 | 火鸡 | 豚鼠 | 人“O”型血 |
终浓度 | 0.5 | 0.5 | 0．75 | 0．75 |
孔底部形状 | V型 | V型 | U型 | U型 |
孵育时间 | 30分钟 | 30分钟 | 60分钟 | 60分钟 |
细胞对照 | 细胞沉积成泪滴状，倾斜时细胞向下流 | 细胞沉积成泪滴状，倾斜时细胞向下流 | 细胞沉积成环状 | 细胞沉积成环状 |
2．处理后血清中有无残留非特异性凝集素
（1）选用适当的微量板，从B1至H6中加入25μlPBS；
（2）A1到A5各加50μl处理后的血清，A6加50μlPBS；
用多道加样器从A1行开始，各孔取25μl血清，由A行至H行进行2倍稀释血清；
（3）H行各孔稀释混匀后其取25μl；
（4）每孔补加25μlPBS；
（5）每孔加入50μl红细胞悬液，混匀；
（6）置室温（22～25℃）孵育30～60分钟，观察有无凝集，如出现凝集则表示血清中有残余的非特异性凝集素。该血清必须用红细胞吸附去除非特异性凝集素后才能使用。
3．红细胞吸附去除非特异性凝集素：
（1）体积的红细胞可以去除20倍体积的RDE处理过的血清；
（2）红细胞与血清混匀后，置4℃一小时；
（3）1200rpm离心10分钟；
（4）小心吸取上清液；
（5）重复操作直至血清中的非特异性凝集素被去除。
4．红细胞凝集试验（HA）检测待检病毒滴度
（1）根据所用的红细胞种类选用适当的微量板。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1成为第一列；平行方向称行，如A1～A12成A行；
（2）除第一列各孔外（A1～H1），其余每孔加50μlPBS；
（3）A1～F1各加100μl标准抗原或待检病毒。H1加100μlPBS作为阴性对照；
（4）用多道加样器从第一列各孔分别取50μl病毒液，由第一列至第12列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μl；
（5）每孔加入50μl红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合；
（6）室温孵育30～60分钟，观察血凝现象并记录结果；
（7）红细胞凝集以“＋”记录；只有部分红细胞凝集记录为“＋/-”；无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
5．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原
（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量；
（2）制备4个单位血凝抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μl抗原，那么测定一份血清须0.2ml抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原；
（3）其次，计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即为4个血凝单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。1：8（1ml病毒液加7mlPBS）稀释该病毒即可得到4个血凝单位。
注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25μl病毒液中含有4个血凝单位（等于50μl病毒液中含有8个血凝单位）。
为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个血凝单位抗原须复核滴定：取50μl稀释好的抗原，用等量PBS做2倍系列稀释（同病毒滴定）后加入50μl红细胞悬液，至室温孵育30～60分钟观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50μl病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5孔也出现凝集，说明每50μl病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50μl病毒仅含有4个血凝单位，病毒量须加倍。此外，4个血凝单位抗原必须每次用前新配制。
6．红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒
本试验采用国家流感中心提供的流感标准参照抗原和抗血清
根据所用的红细胞选用适当的微量板
（1）除A行外，每孔各加25μl PBS。A5、A6各加50μlPBS作为阴性对照；
（2）国家流感中心提供以下4种抗血清：
抗A（H1N1）亚型血清
抗A（H3N2）亚型血清
抗B型Yamagata系病毒血清
抗B型Victoria系病毒血清
（3）A1至A4及A7至A10分别加入上述处理好的标准血清，每孔50μl；
（4）用多道加样器从A行分别取25μl血清，由A行至H行做2倍系列稀释血清，弃去H行25μl；
（5）A1至H5每孔加入25μl待检病毒液1（4个血凝单位的抗原）；
（6）A7至H10每孔加入25μl待检病毒液2（4个血凝单位的抗原）；
（7）对照孔（A5、A6）不加抗原，用25μlPBS代替；
（8）混匀，至室温孵育30～60分钟，观察红细胞凝集抑制试验结果；
（9）另取血凝板同样做标准血清对照。
当特定的抗体与相应的血凝抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1：80稀释的血清孔不出现凝集（完全抑制），1：160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。
标准参照血清对待检抗原的抑制效价≥20才可以算为阳性。
一个待检抗原不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制。
待检病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此种流感病毒。
红细胞凝集抑制试验不仅可以用于鉴定待检病毒的型别及亚型，也常用于检测同型别病毒间的抗原性变异情况。
7．红细胞凝集抑制试验注意事项
（1）血红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位/25μl的抗原，抗原必须新鲜配制；
（2）孵育时间准确，有些病毒引起的凝集现象因病毒游离消失很快，这时应将反应板放置4℃，或缩短孵育时间；
（3）红细胞悬液的配制必须标准化；
（4）正确存放试剂，避免反复冻融及污染；
（5）冻干的试剂应按照说明溶解，保存。
8．确定待检病毒的血凝抑制试验包括以下对照：
（1）红细胞对照；
（2）阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；
（3）标准血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰；
（4）详细记录实验过程。
9．红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验的其他限制因素
（1）病毒在不同宿主中的生长能力。流感病毒的进化常常导致宿主范围改变。长期以来，分离培养流感病毒最常用的是鸡胚。但是近年来一些流行株很难用鸡胚分离成功，所以很多实验室改用MDCK细胞或原代猴肾细胞分离流感病毒。用细胞培养分离传代的病毒HA滴度一般较鸡胚传代病毒低。MDCK细胞传代数的高低影响其对病毒的敏感性，应尽量选用代数较低的细胞。
（2）病毒对各种红细胞的凝集能力。流感病毒能凝集禽类或一些哺乳类动物的红细胞。但是位于血凝素上受体结合部位的氨基酸发生点突变，则可影响病毒对某些红细胞的凝集能力。鸡红细胞是较常用的一种红细胞，因其方便易得、富余时间较短、红细胞凝集抑制结果清晰易读。但是近年来发现有些病毒，特别是新分离出的病毒或代数较低的病毒不能凝集鸡红细胞。如果遇到这种情况，应更换豚鼠红细胞。除此之外，火鸡红细胞也较常用。
（3）非特异性血凝抑制素。人和动物血清中都存在有非特异性抑制素。非特异性抑制素实质上是游离在血清中类似流感病毒受体的唾液酸残基。这些类似受体的多糖类物质能与病毒血凝素分子上的受体结合部位结合，因此用于血凝抑制或其它试验的血清必须彻底清除其中所含的非特异性血凝抑制素。人和动物血清中的非特异性血凝抑制素分为α、β、γ三种，这三种抑制素对不同的病毒的抑制能力不同。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。
（六）红细胞凝集抑制试验（HAI）测双份血抗体
1.生物安全要求
生物安全级别：生物安全二级
如果采用灭活的流感病毒进行血清学诊断时，可以在生物安全一级实验室里进行操作，并应当遵守生物安全一级实验室的有关生物安全的规定。
2.实验材料
（1）待检血清：待检血清必须先经RDE处理去除非特异性抑制素；
（2）标准化的红细胞悬液；
（3）已知标准抗原（由国家流感中心提供的试剂盒内的4种标准参照抗原）：
A（H1N1）亚型代表毒株标准抗原
A（H3N2）亚型代表毒株标准抗原
B型Yamagat系代表毒株标准抗原
B型Victoria系代表毒株标准抗原
（4）制备4个血凝单位抗原：本试验选用A（H3N2）亚型病毒作为已知抗原。配制方法同前。
3.实验步骤
（1）根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板；
（2）除A行外，每孔加入25μlPBS 缓冲液；
（3）按以下顺序，再A行各孔加入处理过的血清50μl：
A1：待检血清标本1，急性期血清
A2：待检血清标本1，恢复期血清
A3：待检血清标本2，急性期血清
A4：待检血清标本2，恢复期血清
A5：待检血清标本3，急性期血清
A6：待检血清标本3，恢复期血清
A7：待检血清标本4，急性期血清
A8：待检血清标本4，恢复期血清
A9：A（H1N1）亚型标准抗血清
A10：A（H3N2）亚型标准抗血清
A11：B型Yamagata系标准抗血清
A12：B型Victoria系标准抗血清
（4）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μl血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μl；
（5）红细胞凝集抑制试验板：每孔加入25μl新配制的4个血凝单位抗原，
血清对照板每孔加入25μlPBS；
（6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合；
（7）室温孵育15分钟；
（8）每孔加入50μl红细胞悬液，混匀；
（9）室温孵育30～60分钟；
（10）观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。 红血球吸附实验（HAd）
（一）生物安全要求
操作应在二级生物安全柜中进行。
（二）实验材料
0.5%豚鼠血球
倒置显微镜
1、每支MDCK，LLC-MK2中加入100ul0.5%豚鼠血球细胞。
4℃下放置30分钟。
在光学显微镜下观察结果：
阳性----RBCs呈簇状成团被吸附在细胞上或者飘浮在培养液中
阴性--- 单个RBCs散状飘浮。
如果结果呈阳性，进行IF实验。
8.4 IF实验6．免疫荧光实验
7．胶体金实验
8．荧光RT－PCR检测
8.4.1制备细胞涂片
（1）当细胞出现CPE时，将培养液存放在无菌的保存管中以备其他的实验（如果已经做了HAd实验为了防止留在管中的RBCs对HA/HAI实验有影响，应当将培养液冻融，使红细胞破裂）
（2）用PBS将管中留下的细胞层洗3次.
（3）刮取细胞，并将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
（4）当疑似是流感CPE时应当做4个孔：2孔作A，B型流感鉴定，2孔做H1，H3亚型鉴定.当HAd阳性或者出现疑似副流感2型的CPE时应当做7个孔： 2孔作A，B型流感鉴定，2孔做H1，H3型鉴定，三孔分别做副流感1，2，3型鉴定.如果HAd实验阳性，但是IF实验阴性，需要再做副流感4型IF.
（5）烘干并用丙酮固定10分钟。
8.4.2直接IF法
（1）每孔加入10ul相应的单克隆抗体-FITC结合物（流感A，流感B，副流感1，2，3或4），并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置15分钟（流感A，流感B，副流感1，2，3）或者30分钟（副流感4）。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（6）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（7）所有的结果应当有另一人复核。
8.4.3间接IF法
（1） 每孔加入10ul相应的单克隆抗体 （A型流感H1，H3， H5亚型），并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置30分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟，并重复一次。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5） 每孔加入10ul anti-mouse-FITC结合物，涂匀。
（6）重复步骤（2）至（4）。
（7）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（8）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（9）所有的结果应当有另一人复核。 免疫荧光方法检测流感病毒
（一）原理
流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。
（二）标本处理
标本采集最好用负压抽取法收集的呼吸道分泌物。
1. 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。
2. 使用吸管吹打悬浮液数次。
3. 2000 rpm离心5分钟。
4. 保留上清液做培养。
5 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。
6. 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。
（三）间接免疫荧光法
1. 在特富龙涂层的12孔显微载玻片的每个孔上加入10 µl细胞悬浮液。
2. 用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥。
3. 用100 ％冰丙酮室温10分钟固定载玻片。
4. 室温晾干载玻片。
5. 每孔加10 µl 流感相应亚型的特异性抗体（1：1000）
6. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
7．pH7.2 PBS洗涤1分钟。
8. 室温晾干载玻片。
9. 每孔加入10 µl 1：20 兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1 % 伊纹氏蓝（Evans Blue）做负染。
10.玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
11.pH7.2 PBS洗涤1分钟。
12.室温晾干载玻片。
13.加上盖玻片，加上甘油。
14．在400X 荧光显微镜镜下检查。
（四）结果判断
阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。观察到三个以上荧光阳性即可判为阳性。 流感/人禽流感实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测
一、基本原理
实时荧光定量（Real-time ）RT-PCR术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。
（一）荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料
1．TaqMan荧光探针：PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号可被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将与PCR产物杂交形成双链的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2．SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
（二）相关的几个概念
1．Ct值：C代表CyCle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 。
（2）阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。
3．基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取6～15个循环的平均荧光信号值。
4．Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
二、实验试剂
1．引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物
2．RT-PCR酶
3．RT-PCR反应液
4．Taq酶
5．无RNA酶的水
6．阳性对照（非感染性体外转录RNA）
7．阴性对照
8．无RNA酶的水
三、实验步骤
（一）核酸提取
方法同RT-PCR的快速诊断。
（二）RT-PCR反应体系配置
1．配置反应体系
从试剂盒中取出相应的 RT-PCR反应液、Taq酶，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。设所需PCR数为n（n ＝ 样本数 ＋ 1管阴性对照 ＋ 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂 | RT-PCR反应液 | Taq酶 |
用量 | 9.8μl | 0.2μl |
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/2颗RT～PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装10μl。
2．加模板
在各设定的PCR管中分别加入RNA溶液各10μl，盖紧管盖，放入荧光 PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。
（三）RT-PCR反应
1．循环条件设置
程序 | 循环数 | 温 度（摄氏度） | 反应时间（分钟：秒） |
1 | 1 | 42 | 30：00 |
2 | 1 | 92 | 3：00 |
3 | 5 | 92 | 10 |
45 | 30 | ||
72 | 1：00 | ||
4 | 40 | 92 | 10 |
60 | 30 | ||
5 | 1 | 40 | 0 |
2．仪器检测通道选择F1通道。
（1）结果分析条件设定
读取F1通道的检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
（2）质控标准
阴性对照的检测结果为阴性。
阳性对照的Ct值应小于等于28.0。
否则，此次实验视为无效。
（四）结果判断
（1）Ct值无数值的样本为阴性样本。
（2）Ct值≤30.0的样本为阳性。
（3）Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
（五）问题解决
1．若阴性对照出现扩增，可以考虑由于环境污染而造成的假阳性。此时应设立空白对照检测：在实验当天取一盛有500μl纯水的1.5ml离心管置于工作台，并于实验结束后作为待检样品检测，检测结果应为阴性。若出现阳性则说明发生环境污染，此时应对室内进行通风、擦洗工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所有自备试剂。
2．阳性对照Ct值大于30，则应考虑RNA降解，此时应对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，并严格按操作流程进行实验。 快速诊断试剂盒*
流感快速诊断试剂盒可以用于暴发疫情标本的快速检测，目前全世界有10种市场化的流感快速诊断试剂盒，其中9种为检测流感病毒的NP抗原，1种检测流感病毒的NA抗原。快速诊断试剂盒的优点是：能在30分钟内提供快速诊断试验结果；能够帮助检测流感爆发；可以在临床中使用；适用于多种情况，操作简便。但是这些试剂盒的缺点是：比病毒培养或RT-PCT准确性要低；有一些诊断试验不能区分甲型和乙型流感病毒的感染；没有诊断试验能区分甲型流感病毒的各亚型；没有毒株、分子生物学和抗原特征的信息。各种诊断试剂盒的使用参照试剂盒说明书。
现有的试剂盒可以分为以下三类：
1. 只检测甲型流感病毒
·Directigen Flu A
2. ·检测和区分甲型和乙型流感病毒Directigen Flu A ＋ B； FLU OIA A/B FLU OIA A/XPECT FLU A/B； NOW FLU A/B
Flu A .B； B； Influ B Quick
3. ·检测但不能区分甲型和乙型流感病毒QuickVue Influenza Test
FLU OIA ZstatFlu 免疫荧光实验（IF）
（一）检测样本
病人呼吸道标本的脱落细胞，或培养一周后CPE不明显但HAd为阳性的细胞培养物。
（二）实验步骤
1． 制备细胞涂片
（1）病人的呼吸道标本
最好采集用负压抽取法收集的呼吸道分泌物作为检测样本。
① 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。
② 使用吸管吹打悬浮液数次。
③ 2000 rpm离心5分钟。
④ 保留上清液做培养。
⑤ 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。
⑥ 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。
⑦将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
⑧ 每个样本需要做两个孔进行A，B型流感鉴定。
⑨ 烘干并用丙酮固定10分钟。
（2）细胞培养物①当细胞出现CPE时，将培养液存放在无菌的保存管中以备其他的实验（如果已经做了HAd实验为了防止留在管中的RBCs对HA/HAI实验有影响，应当将培养液冻融，使红细胞破裂）
②用PBS将管中留下的细胞层洗3次。
③刮取细胞，并将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
④每个样本需要做两个孔进行A，B型流感鉴定。
⑤烘干并用丙酮固定10分钟。
2直接IF法
（10）每孔加入10ul相应的单克隆抗体-FITC结合物，并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（11）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置15分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（12）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟。
（13）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（14）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（15）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（16）所有的结果应当有另一人复核。
3间接IF法
（1） 每孔加入10ul相应的单克隆抗体，并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置30分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟，并重复一次。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5） 每孔加入10ul anti-mouse-FITC结合物，涂匀。
（6）重复步骤（2）至（4）。
（7）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（17）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（18）所有的结果应当有另一人复核。
（三）结果判断
阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。 胶体金实验
（一）适用范围
本检测细则适用于用创新科技生产的凯必利甲型乙型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒对鼻腔抽吸液、鼻腔擦拭液和咽喉擦拭液标本中甲型乙型流感病毒进行定性测定。
（二）检测项目及参数：
甲型流感病毒检测试剂盒的最小检测灵敏度是：3.0×104TCID50/每次检测。
乙型流感病毒检测试剂盒的最小检测灵敏度是：1.5×105TCID50/每次检测。
（三）样本采集：
1鼻腔抽吸液的采集方法：
抽吸器一侧的管子连接在抽吸泵上，另一侧的管子从外鼻孔完全插入鼻腔。启动抽吸泵采集鼻腔液在抽吸器中。
2鼻腔擦拭液的采集方法：
将灭菌的棉棒完全插入鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集粘膜表皮。
3咽喉擦拭液的采集方法：
将灭菌的棉棒从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，摩擦数次，采集粘膜表皮。采集时，要注意不要触碰到唾液。
备注：①采集的样本应当尽早按照下述调制的方法进行样本处理。
②因去除细胞成分会降低灵敏度，所以在进行样本测试前，勿离心分离。
③所有的样本都应视作具传染性，操作时应做好防护。
（四）操作方法：
1样本的前处理：
（1）鼻腔抽吸液
将鼻腔抽吸液0.5ml悬浊于运输培养基或2ml生理盐水中。在已经加入了样本抽提液的抽提用管子中加入0.5ml悬浊液（到上方的基线为止），充分混和后作为样本待测。
（2）鼻腔擦拭液和咽喉擦拭液
将采集了样本的棉棒浸在抽提用管子中的样本抽提液中，并搅拌。从抽提用管子的外侧，用手指挤压灭菌棉棒数次，使样本抽提液充分浸透棉棒，然后取出棉棒，绞出的液体作为样本待测。
2检测方法
（1）将附属的喷嘴插入抽提用管子上端。
（2）捏紧抽提用管子，使样本滴下3滴到检测板的样品滴下部。
（3）15分钟后观察检测板的判定部。按如下方法进行判定。
（五）结果判定：
根据操作方法使其发生反应，结合C位及T位显示紫红色条带的情况进行判定。
（1）阳性：图略
（2）阴性：图略
（3）再检测：图略
不要在15分钟之内判定结果。超过了判定时间的检测板，因干燥等原因，有时结果会发生变化。请在样本滴下后60分钟以内进行判定，超过60分钟时，请用别的检测板重试。当C位无紫红色的条带出现，可认为是测定操作上出现问题，应当请用别的检测板重试。
（六）注意事项：
（1）该试剂盒是用于快速检测试剂，还需结合临床症状、病毒的分离培养及其他的检测结果综合判断进行确诊。
（2）试剂盒应存放在2－30℃中，避免高温潮湿及阳光直射。
（3）使用前，不能打开装有检测板的铝箔袋。
（4）勿用手直接接触检测板的样本滴下部及判定部。
（5）在使用附属的棉棒时，待样本抽提后，应迅速拔去棉棒，因其长时间浸泡中心轴会吸水。
（6）因棉棒是纸做的，在操作时应当小心操作以防断裂。
（7）对于很粘稠会堵塞过滤网的样本，请用样本抽提液稀释后再使用。
（8）测定使用过的检测板、灭菌棉棒、抽提用管子、喷嘴、残余样本应视为传染性物质，应按照相关要求处理。
（9）样本抽提液中含有0.09％的作用防腐剂的叠氮化钠。含有叠氮化钠的液体长期废弃在金属的排水管中，有时会生成有爆炸性的叠氮化物，所以废弃时应当用大量的水一起排出。
（七）支持性文件：
创新科技凯必利甲型乙型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒说明书。 H5亚型荧光RT－PCR检测
（一）适用范围
本检测细则适用于进行H5亚型荧光RT-PCR检测。
（二）参数
最低检测极限为10-6TCID50。
（三）检测仪器设备
Roche Lightcycler荧光PCR检测仪。
（四）样本处理及试剂配套
1样品种类
（1）咽拭子、鼻拭子
（2）咽漱液
（3）呼吸道标本（适用于气管插管病人）
（4）痰液标本
（5）血液标本
（6）尸检组织标本
2．样品存放
制备号的样品在2℃∽8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存置-70℃以下，但因避免反复冻溶（冻溶不超过3次）
3．最少样品量：100ul
4．试剂及配套品：
试剂：深圳匹基试剂
最少样品量：50ul
试剂及配套品：
试剂1：抽提RNA试剂，-20℃预冷。
试剂2：样本处理试剂，4℃保存，6个月有效。
试剂3：RT-PCR试剂，RT-PCR酶在室温下置于干燥器内保存，其它试剂-20℃保存。
标准品：-20℃保存。
（五）操作方法
1样品处理（样品处理区进行）
（1） 取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阴性对照和阳性对照在试剂盒中已标出），编号。
（2） 每管加入600uL裂解液、分别加入被检样本、阳性对照、阴性对照各200uL，一份样本换用一个吸头，再加入200uL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。
（3） 取与8.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入500uL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500uL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
（4）于4℃、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干）；加入600uL75％乙醇，颠倒洗涤。
（5）于4℃、12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干）。
（6） 4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残留液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。
（7） 加入11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA需在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。
2．扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后稍离心。
设所需要的PCR管数为n，其中n为被检样品、阳性对照和阴性对照的和每个样品测试反应体系配制如下表：
试剂 | RT-PCR反应液 | Taq酶 |
用量 | 15ul | 0.25ul |
根据检测样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，向其中加入0.25/n颗RT-PCR反逆转录酶颗粒，充分混合均匀后，向每个荧光RT-PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。
3．加样（样本处理区）
在所设定的n个PCR薄壁管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、阳性对照各10ul，盖紧管盖，将PCR薄壁管放在离心机中，于4000rpm离心5sec，转移至检测区，置于iCycler PCR仪上并记录样本摆放顺序。
4． PCR扩增（检测区）
循环条件设置
第一阶段：反转录42℃/30min；
第二阶段：预变性92℃/3min；
第三阶段：92℃/10s，45℃/30s，72℃/60s，5个循环；
第四阶段：92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。实验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
（六）结果判定
1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增线的最高点为准。
2质控标准
（1）阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
（2）阳性对照的Ct值应＜28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
3结果描述及判定
（1）阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒
（2）阳性
Ct值≤30，并出现典型的扩增曲线，表示样品中存在禽流感病毒。
（3）有效原则
Ct＞30的样本建议重做。重做的结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。
（七）支持性文件
《禽流感病毒H5荧光RT-PCR检测方法操作说明书》
《禽流感病毒H5荧光RT-PCR检测方法GB/T19438.1-2004》
附件6
流感爆发疫情样本指引
标本采集由当地疾控中心流病科人员负责采集发病3天内且没有服用过抗病毒药物的疑似流感病例的鼻咽拭子或咽漱液。采集人员需填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”，并将标本在4℃保存下，24小时之内送到实验室，未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。 实验室检测
流感样病例暴发疫情中常用的检测方法有流感快速诊断试剂盒检测、RT－PCR检测和病毒分离培养。其中流感快速检测和RT－PCR检测可用于早期、快速的实验室检测。无论是否进行流感快速诊断试剂盒检测和RT－PCR检测，都应进行常规的流感病毒分离鉴定。尤其是流感快速检测和RT－PCR检测阳性的标本，应尽量分离到流感病毒。
1.RT－PCR法检测病毒核酸
RT－PCR法是检测流感病毒核酸的方法，能检测出非常低水平的流感病毒的核酸，不管病毒是否具有活性均可进行测定。可选择区分流感病毒的A型通用引物、B型引物同时进行试验，具体方法见附件 。
2.流感快速诊断试剂盒检测
流感快速诊断试剂盒可检测流感病毒的NP抗原和M1抗原，用于暴发疫情中病例咽、鼻拭子或含漱液标本的快速检测。可在30分钟内提供检测结果，初步判断疫情性质，可在现场中使用，操作简便，具体方法见附件 。
但是这种快速检测比病毒分离培养或RT-PCR的敏感性低，无法确定流感病毒的亚型，结果只能用作参考。
3.病毒分离鉴定
病毒分离鉴定是流感实验室诊断中最常用、高度敏感、最准确的方法之一，所分离到的病毒可长期保存，并进行抗原性分析。因此在暴发疫情中，常规用于实验室检测，具体内容同流感样病例的病原学监测。
附件7
流感实验室检测工作指引
流感检测实验室生物安全规定：（一） 流感检测实验室的生物安全基本原则：
（二） 实验室的相关生物安全管理规定：
（三） 建立实验室人员准入制度：
（四） 实验室实行分级、分区管理
（五） 良好的微生物学技术操作规范
（六） 实验室废弃物处理规定
（七） 意外事故处理办法（记录、报告）及应急预案
（八） 实验室消毒和灭菌
（九）流感实验室检测中应注意的问题 禽流感职业暴露人员防护要求
1.防护用品
2.防护用品的穿脱顺序
3.分级防护原则
4.对手清洗和消毒的要求和方法 流感样标本的采集、运送、接受、及处理
（一）采样准备
（二）采样方法
（三）标本的运送
（四）标本的接收
（五）标本的处理 流感病毒的病原学监测
（一）样本采集
（二）样本的接收
（三）病毒的分离培养
（四）病毒的鉴定 流感暴发疫情样本的检测
（一）标本采集
（二）实验室检测
1.RT－PCR法检测病毒核酸
2.流感快速诊断试剂盒检测
3.病毒分离鉴定 毒株的鉴定及上送
对各区监测实验室上送的及本实验室的血凝阳性标本，应于2周内用HI实验进行流感病毒的型别鉴定。经初步鉴定后全部上送国家流感中心及广东省疾病预防控制中心进行确证。
（一）流感毒株的送检要求
1.流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA≥1：8；
2.暴发疫情采样分离到的所有毒株；
3.认真填写流感/人禽流感毒株送检单各项内容；
4.所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。
（二）寄送流感毒株标本的包装、运输
1.病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本；
2.将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封；
3.直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填写在送检单内，送检单应单独放在防水的袋子里；
4.将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具防水和缓冲能力的材料。
（三）毒株的保存管理
所有的流感毒株进行登记，填写“流感毒株保存记录表”，以备复核；毒株鉴定完成后，液体毒株应在－70℃及以下保存3年，干燥管可以长期保存；分离毒株的原始标本保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，方可弃去。 人禽流感待查病例的检测
（一）标本采集
医疗机构配合当地疾病预防控制中心专业人员采集病例标本，采集人员要按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》做好个人防护。在现场采集样本的同时，填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”。
1.标本采集种类
病例的鼻咽拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。
2.采集标本时间
（1）咽、鼻拭子或含漱液在发病后1～7天采集；
（2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2～4周采集；
（3）尸检标本尸检时采集。
3.标本的运送
所有标本应在医院采集，一式二份，其中一份单独保存，以备复核。标本应在4℃条件下，尽快（24小时内）送至能开展相关检测的实验室，用于病毒分离的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70 ℃以下保存。血清标本可暂冻存在－20 ℃以下冰箱。
（二）实验室检测
1.RT-PCR
接到标本后，首先应用RT-PCR，对禽流感待查病例的鼻咽拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等标本，进行禽流感病毒核酸的快速检测，具体方法见附件 。
一般情况下， 实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后48小时内出具RT-PCR检测报告。
2.血清学检测
对于急性期血清应用ELISA方法检测禽流感抗体，具体方法。
对患者急性期和恢复期的双份血清，应进行红细胞凝集抑制试验。
3．标本和分离物上送
RT-PCR与血清学检测中，任何一项实验室检测结果阳性的，需将原始标本、可疑阳性标本、血清等，在低温保存条件下，于24小时内送至中国疾控中心进行复核。原始标本、可疑阳性标本和血清须填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”。
4．诊断与排除
所有人禽流感确诊病例、临床诊断病例的排除由国家级专家组进行诊断、判定。
人禽流感待查病例的排除，及人禽流感待查诊断为临床诊断病例时，由各省专家诊断组根据国家流感中心的复核结果进行判断。 血清学检测
（一）一般人群抗体水平的监测
用HI方法进行H1、H3、B（Yamagata）、B（Victory）抗体水平检测，用以比较流行季节前后深圳市人群各型别流感抗体水平的差异，为疫苗接种评价及预测来年的流行毒株提供流行病学资料。
（二）职业人群的监测
用HI方法进行H1、H3、H5、H9、B（Yamagata）、B（Victory）等流感及禽流感病毒型及亚型的血清抗体检测。
附件8
人禽流感病例流行病学调查指引
为预防和控制人禽流感病例的发生和传播，做好人禽流感疫情的流行病学调查，制定本方案。 调查目的
1.为核实病例提供流行病学证据；
2．调查可能的传染源、传播途径及其影响因素，为疫情的预防控制提供科学依据；
3.为研究人禽流感自然史，积累个案调查资料，描述分析流行现状；
4．发现人传人的线索、并寻找其证据，为及时做好流感大流行应对准备提供依据。 调查对象
人感染高致病性禽流感病毒为法定按甲类管理的乙类传染病，县（区）级疾病预防控制机构接到相关疫情报告后，均要及时开展流行病学调查。调查对象为：
1．不明原因肺炎病例；
2．人禽流感待查病例（医学观察病例）、疑似病例、临床诊断病例、确诊病例；
3．其他需要排除人禽流感的病例。 调查内容和方法
（一）调查内容
1. 个案流行病学调查
内容包括：病例基本情况、发病经过和就诊情况、临床表现、实验室检查、暴露因素和密切接触者情况、转归等。详见附表“人禽流感病例个案调查表”。
2. 标本采集
在进行现场流行病学调查时，要注意采集相关标本，标本采集种类、时限和方法参见《人禽流感标本采集及实验室检测技术方案》。
3. 其他调查
（1）动物疫情背景调查
收集与人禽流感发生有关的动物疫情情况。
①当地家禽饲养业的状况：家禽种类，饲养方式、饲养规模、禽流感疫苗免疫接种等。
②当地禽类、鸟类交易情况：交易种类、货物来源、交易方式（有无活禽集市、现场屠宰及防护情况等）。
③当地近年，尤其是近1～2月内发生禽流感或发生禽鸟类病（死）情况：发生时间，动物发病表现，动物死亡的种类、数量和分布（波及的时间、范围），当地动物疫情监测结果（包括农业/林业部门开展的实验室诊断的健康带毒调查）。
④候鸟迁徙情况、近期异常死亡情况、禽流感监测情况。
（2）病例间流行病学联系调查
发现聚集性人禽流感病例及其他不能排除人传人的病例的线索，要仔细调查，寻找人暴露的证据，评估人传人可能性大小。
①发现人间传播的线索：
A.出现聚集性人禽流感病例；
B.人禽流感病例密切接触者中发生病例情况；
C.医务人员感染人禽流感病例，或其他没有禽类接触史的病例。
②重点探寻暴露的证据
A.发病前1周内与禽流感病人和/或疑似禽流感病人的接触情况，最后接触时间、接触方式、接触频率、接触地点、接触时采取防护措施情况等的深入调查核实
B.发病前1周内与病死禽类的接触及防护情况：
-饲养、贩卖、屠宰、加工病（死）禽；
-捕杀、处理病（死）禽；
-直接接触病（死）禽及其排泄物、分泌物等。
C.发病前1周内有无其它接触可疑禽流感病毒污染物（如实验室污染）的情况
D. 发病前一周的活动情况，是否到过禽流感疫区或曾出现病（死）禽的地区旅行。
③病例的密切接触者调查，参照《禽流感密切接触者的判定和处理原则》，尽量搜索可能被传染的人（接触者）。
（3）环境因素调查
可能受到禽流感病毒污染的工作、居住环境调查，必要时可采集环境拭子标本检测禽流感病毒核酸，了解可能的感染来源或污染情况。
①住宅情况（居民楼、合住院落、独立房屋、集体宿舍）及人均居住面积；
②住宅附近农贸市场；
③住宅附近禽鸟类动物养殖场所；
④其他，如近期到医院就诊或探访病人情况。
（4）病例对照研究
为探索病例的可疑暴露因素，可开展人禽流感病例的病例对照的专题研究。
（5）气象因子调查（由气象部门配合完成）
①病例发病季节；
②气象条件：病例发病前一周（平均最长潜伏期）至发病当天患者所在城市或最接近的一个周边城市的气象参数，包括气温（平均温度、平均最高温度、平均最低温度、气温日较差）、湿度（水汽压、平均相对湿度、平均最大相对湿度、平均最小相对湿度）、风向风速、太阳辐射（日照时数、紫外线）、气压、天气状况（云、雨、雾、灰霾、冷空气）；空气质量（空气污染指数、主要污染物）等。
③气候条件：病例所处地理位置（经度、纬度、气候带）；病例当年厄尔尼诺、拉尼娜、太阳黑子活动情况等。
（二）调查方法
1.调查者
应由经过培训的县（区）级疾病预防控制机构专业人员进行。现场调查者应做好个人防护，个人防护参照“人禽流感消毒、隔离和个人防护技术方案”执行。
现场调查时，应尽可能直接对病人进行访视和询问。如因病人病情较重、死亡或其他原因无法直接调查，或必要时，可通过其亲友、医生、同事或其他知情者进行调查核实或补充。
2.调查时间
流行病学调查应在人禽流感待查病例（医学观察病例）或预警病例报告后迅速开展。病例个案调查表填写内容要完整，对病人转归等情况要及时进行补充，完善调查表中的相关信息。
3．动物疫情资料来源
禽鸟类动物及其发病情况资料可通过与农业、林业、工商等部门的协调获取，必要时可进行现场补充调查得到。 资料的管理和利用
1.在疫情调查处理进程中或结束后，应及时完成流行病学调查报告并及时上报上级疾控机构和同级卫生行政部门。各省疾控中心同时将人禽流感病例流行病学调查表和流行病学调查报告报中国疾控中心疾病控制与应急处理办公室。
2.流行病学调查原始资料、汇总分析结果、调查报告及时整理归档。
3．定期对积累的流调资料进行分析。
人禽流感病例流行病学个案调查表
国标码□□□□□□ 病例编码□□□□
病例类型：（1）确诊 （2）临床诊断 （3）疑似 （4）待查
1．一般情况
1.1姓名： （若是儿童，请填写家长姓名： ）
1.2联系电话
1.3身份证号码：□□□□□□□□□□□□□□□□□□（家长身份证号码）
1.4性别：⑴男 ⑵女
1.5出生日期： 年 月 日（如出生日期不详，实足年龄：岁 月 天）
1.6职业：⑴幼托儿童 ⑵散居儿童 ⑶学生 ⑷教师 ⑸保育保姆
⑹餐饮业 ⑺商业服务 ⑻工人 ⑼流动就业人员 ⑽农民
⑾牧民 ⑿渔（船）民 ⒀干部职员 ⒁离退人员 ⒂家务待业 ⒃其他
1.7工作单位：
1.8现住址： 省 市 县（区） 乡（街道） 村
1.9户 籍： 省 市 县（区） 乡（街道） 村
1.10现患基础疾病 ⑴有，病名： ⑵无 ⑶不详
1.11流感疫苗接种史： ⑴有 ⑵无 ⑶不详
如有，最后一次接种日期： 年 月 日
1.12免疫球蛋白接种史： ⑴有 ⑵无 ⑶不详
如有，最后一次接种日期： 年 月 日
2．发病与就诊
2.1发病日期： 年 月 日
2.2发病地点： 省 市 县（区）
2.3就诊情况（发病到调查时的诊治经过）
就诊日期 | 就诊医院和科室 | 诊断疾病名称 | 住院日期 | 住院号 |
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3.临床表现
3.1 首发症状（描述）：
3.2 发热： ⑴有，体温（最高） ℃ ⑵无
3.3 咳嗽： ⑴有 ⑵无 3.4 咳痰：⑴有 ⑵无
3.5 鼻塞： ⑴有 ⑵无 3.6 流涕：⑴有 ⑵无
3.7 头痛： ⑴有 ⑵无 3.8 咽痛：⑴有 ⑵无
3.9 全身酸痛 ⑴有 ⑵无 3.10乏力：⑴有 ⑵无
3.11 胸闷 ⑴有 ⑵无 3.12气促：⑴有 ⑵无
3.13呼吸困难 ⑴有 ⑵无 3.14腹泻：⑴有 ⑵无
3.15 结膜炎 ⑴有 ⑵无
4.暴露和接触情况
4.1 发病前1周内接触禽流感病人情况：⑴是 ⑵否 （3）不详
患者 姓名 | 发病 时间 | 诊断 | 与患者关系 | 最后接触时间 | 接触 方式* | 接触 频率# | 接触 地点 |
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注： * 接触方式： ⑴共同进餐 ⑵同处一室 ⑶同一病区 ⑷共用食具、毛巾、玩具等
⑸接触病人分泌物、排泄物等 ⑹诊治、护理 ⑺探视病人 ⑻其他接触
# 接触频率指发病前一周情况，分为每天、数次（写明日期或日期范围）、仅一次
4.2发病前1周内接触禽鸟类等动物情况： ⑴有 ⑵无 （3）不详
接触动物情况 | 接触方式 |
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动物 名称 | 接触 地点* | 接触 频率# | 最后接触时间 | 饲养 | 销售 | 购买 | 宰杀 | 烹饪 | 排泄物分泌物 | 玩耍 | 手部伤口 | 其他 |
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注：* 接触地点包括家中、工作单位、市场、饭店、公园等；
# 接触频率填写发病前一周情况，分为每天、数次（写明日期或日期范围）、仅一次。
4.3 发病前1周是否到过有禽流感疫情的地方：（1）是 （2）否 （3）不详
4.3.1若是，具体时间： 年 月 日
4.3.2详细地点： 省 市 县（区） 乡（街道） 村
4.3.3 发病前1个月，你生活或工作过的范围内是否有禽鸟的异常死亡？
（1）是 （2）否 （3）不详
4.4 其他
4.4.1发病前一周内，曾到医院（就诊、看望病人等） （1）是 （2）否 （3）不详
4.4.2发病前一周内，到过禽流感病毒学实验室 （1）是 （2）否 （3）不详
4.5个人卫生习惯
4.5.1 接触家禽后是否洗手： （1）经常 （2）偶尔 （3）从不
4.5.2 平时与病人接触病人是否洗手： （1）经常 （2）偶尔 （3）从不
4.5.3 平时与病人接触病人是否戴口罩： （1）经常 （2）偶尔 （3）从不
5．发病至隔离治疗前的密切接触人员情况
接触者 姓名 | 性别 | 年龄 | 与患者关系 | 接触方式* | 住址（或工作单位） | 电话 号码 | 是否发病 |
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注： * 接触方式： ⑴共同进餐 ⑵同处一室 ⑶同一病区 ⑷共用食具、毛巾、玩具等
⑸接触病人分泌物、排泄物等 ⑹诊治、护理 ⑺探视病人 ⑻其他接触
6.实验室检查：
6.1 血常规： 年 月 日 WBC： ×109/L；N %；L %
年 月 日 WBC： ×109/L；N %；L %
年 月 日 WBC： ×109/L；N %；L %
6.2胸部Ｘ线检查： 年 月 日 结果：
年 月 日 结果：
年 月 日 结果：
6.3血清学和病原学检测：
标本种类 | 采样时间 | 检测项目 | 检测方法 | 检测单位 | 结 果 |
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注：标本类型包括咽拭子、含漱液、痰、血清、粪便等
7. 转归与最终诊断情况：
7.1最后诊断：⑴确诊禽流感 ⑵排除（其它疾病名 ）
7.2转归： ⑴痊愈 ⑵死亡 （3）转院 （4）其他
7.2.1若痊愈，出院日期 年 月 日
7.2.2若死亡，死亡日期 年 月 日 死亡原因
7.2.3若转院，转院日期 年 月 日 转往医院
8. 调查小结
调查单位：
调查时间： 年 月 日
调查者签名：
人禽流感病例个案调查表填表说明
1. 国标码：使用6位国标码，填写调查地区的国标代码。
2. 病例编码：禽流感病例和疑似病例分别编码。
3. 凡是数字，都用阿拉伯数字如：0、1、2、3、……。
4. 用铅笔或圆珠笔填写，字迹要清楚易认。
5．凡选择项，应在相应位置划“圈”。
6. 暴露因素和接触者情况调查请注意相关表注，接触方式只需在表中填写相应代号，如符合“⑵同处一室”则只需在表中相应位置填写“2”。
表1
医院/社康中心/医务室/家禽饲养场流感样病例原始登记表
编号 | 就诊日期 | 性别 | 年龄 | 备注 | |
男 | 女 | ||||
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：
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⑵性别一栏请在对应项下打“√”。
填表人： 填表日期：
表2-1
市（区） 医院流感样病例采样送检表
编号： | |||||||||||||||
患者姓名： | 年龄： | ||||||||||||||
性别： | 患儿家长姓名： | ||||||||||||||
联系电话： | 职业： | ||||||||||||||
现住址： | |||||||||||||||
主要临床表现 | 用药情况 | ||||||||||||||
体温
（℃） | 咳嗽 | 咽 痛 | 全身 酸痛 | 其它（请注明） | 金刚烷胺 | 金刚乙胺 | 病毒唑 | 其它 | |||||||
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禽类接触史 | 近两周内有无禽类接触史 | 接触方式 | |||||||||||||
饲养 | 销售 | 屠宰 | 运输 | 其他 | |||||||||||
有： 无： |
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采样种类 | 咽拭子 | 含漱液 | 血清 | 其它（请注明） | |||||||||||
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（1） 采样对象：发病≤3天的流感样病例，病人年龄≤14 岁时，需填写家长姓名。
（2） “主要临床表现”、“用药情况” 和“采样情况”栏打“√”，其余栏目填写相应内容。
（3） 标本采集后应立即在4℃-8℃条件下保存。
发病日期：
采样日期：
送检日期：
采样人： 采样科室：
表2-2
住院肺炎患者采样送检表
姓名： 性别： 年龄：
家庭住址： 电话： 职业：
接触史：2周内是否曾接触禽类动物 是 否
1周内是否曾接触流感样病人 是 否
是否曾到暴发禽流感的疫区 是 否
服药史：发病以来是否曾服用金刚脘胺、奥司他韦类抗病毒药物 是 否
家庭其他成员、密切接触者是否发病 是 否
主要临床症状：发热 ℃ 咳嗽 咽痛 头痛 乏力 胸痛
胸片改变 呼吸急促 呼吸困难 咳血 败血症 其他
白细胞数正常或减少 淋巴细胞计数减少
其他注明：
采集标本：鼻咽拭子、咽漱液 气管吸取物 器官组织
血清：第一份采集时间： ； 第二份采集时间： ；
发病日期：
采样日期：
送检日期：
采样人： 采样单位：
表3-1
市（区） 医院/社康中心/学校医务室流感样病例统计表（周报）
日 期 （年/月/日） | 星 期 | 各年龄组（岁）流感样病例数 | 监测门诊 病例总数 | |||||||
0～ | 5～ | 15～ | 25～ | ≥60 | 不详 | 合 计 | ||||
| 一 |
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| 二 |
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总 计 |
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填表说明：
⑴此表由监测医院/门诊部/学校医务室指定专人填写，每周一将上周的资料进行统计后通过网络直报方式报市疾病预防控制中心。
⑵监测门诊病例总数为在开设流感监测工作的门诊就诊的所有病例总数（不包括未开展流感监测工作的其他门诊科室）。
报告人 报告日期 单位盖章
表3-2
家禽饲养场流感样病例数及缺勤工人总数统计表（周报）
流感样病例：体温》38℃，伴有咳嗽或咽痛等症状的急性呼吸道感染患者
日 期 （年/月/日） | 星期 | 工人总数 | 实到人数 | 缺勤人数 | 上呼吸道感染人数 | 流感样病例数 | 肺炎病例数 |
| 一 |
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总 计 |
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填表说明：
（1）此表由家禽饲养场指定专人填写，每周一将上周的资料进行统计后通过网络直报、E-MAIL或传真方式（0755-25627964）报市疾病预防控制中心。邮箱地址：szcdc-hxd@163.com；
（2）上呼吸道感染人数主要指体温《38℃的普通感冒病例。
（3）出现流感样病例数、肺炎病例或家禽异常死亡情况请立即报告市疾病预防控制中心，市疾病预防控制中心安排人员前往调
查采样检测。
报告人 报告日期 单位盖章
表3-3
姓名： 性别： 年龄：
家庭住址： 电话： 职业：
发病日期： 治疗情况：
接触史：2周内是否曾接触病死家禽类动物 是 否
1周内是否曾接触流感样病人 是 否
是否曾到暴发禽流感的疫区 是 否
服药史：发病以来是否曾服用金刚脘胺、奥司他韦类抗病毒药物 是 否
家庭其他成员、密切接触者是否发病 是 否
主要临床症状：发热 ℃ 咳嗽 咽痛 头痛 乏力 胸痛
胸片改变 呼吸急促 呼吸困难 咳血 败血症 腹泻
白细胞数正常或减少 淋巴细胞分类计数减少
其他注明：
填表人： 填表日期：
表4-1
流感病毒鸡胚分离实验记录
标本 编号 | 培养 代数 | 血球 类型 | 鸡胚 （1） | 鸡胚 （2） | 鸡胚 （3） | 备注 | |||
尿囊液 | 羊水 | 尿囊液 | 羊水 | 尿囊液 | 羊水 | ||||
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接种日期 收获日期 鉴定日期 .
分离人 复核人 .
表4-2
流感病毒MDCK细胞分离实验记录
标本编号 | 培养 代数 | 血球 类型 | MDCK （1） | MDCK （2） | MDCK （3） | 备注 |
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接种日期 收获日期 鉴定日期 .
分离人 复核人 .
表5
市（区）流感毒株送检单
标本编号 | 患者姓名 | 性别 | 年龄 | 发病 日期 | 采样 日期 | 分离 日期 | 分离方法 | 传代 记录 | 血凝 效价 | 毒株 亚型 | 标本来源1 | ||
鸡胚 | 细胞 | 医院监测 | 暴发监测 | ||||||||||
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注：1、标本来源：须注明具体地点。
送检人： 送检日期： 年 月 日
送检单位（盖章）：
表6
年 月 市（区）流感病毒分离情况按周统计表
| 年龄组 | 周（ 月 日至 月 日） | 周（ 月 日至 月 日） | 周（ 月 日至 月 日） | 周（ 月 日至 月 日） | ||||||||
采样数 | 检测数 | 阳性数 | 采样数 | 检测数 | 阳性数 | 采样数 | 检测数 | 阳性数 | 采样数 | 检测数 | 阳性数 | ||
常 规 哨 点 监 测 | 0- |
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5- |
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15- |
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25- |
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≥60 |
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暴发 疫情 监测 | 0- |
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5- |
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15- |
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25- |
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≥60 |
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合计 |
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填表说明：
（1）此表由区疾控中心实验室人员填写，每月5日前通过E-MAIL报市疾控中心微检科，EMAIL地址：szcdc-hxd@163.com；
（2）“采样数”为本周的实际采样总数，“检测数”为本周实际检测的标本数；
（3）阳性数按市级血凝试验定结果进行填写；
填表人 填表日期
单位盖章
表7
流行性感冒个案调查表
病例编号 □□□□□□□ 一般情况
1．姓名（儿童家长姓名）： （ ）
2．性别（1男；2女） A1□
3．年龄： （岁） A2□□
4．职业 ： A3□
（1）幼托儿童；（2）散居儿童；（3）学生（大中小学）；（4） 教师；（5）保育员及保姆；（6）餐饮食品业；（7）商业服务；（8）医务人员；（9）工人；（10）民工；（11）农民；（12）牧民；（13）渔（船）民；（14）干部职员；（15）离退人员；（16）家务及待业；（17） 不详；（18）其他（ ）
5.是否孕妇？1是； 2否 A4□
6.住址： 市 县（区） 街道（村） 号
7.工作单位/学校 ；
联系电话： . 发病情况
1．发病日期： 年 月 日 B1□□□□□□□□
2．发病地点： 市 县（区）
3．初诊日期： 年 月 日 B2□□□□□□□□
确诊日期： 年 月 日 B3□□□□□□□□
4．诊断医院： ；
5．住院日期： 年 月 日 B4□□□□□□□□
出院日期： 年 月 日 B5□□□□□□□□
6. 转归情况 （1）死亡；（2） 痊愈；（3） 其它 B6□ 临床资料
1．发热持续 天 C1□□
最高体温 ℃ C2□□.□
2．有无如下症状?（1有，0无）
C3发热□ C4畏寒□ C5乏力□ C6咳嗽□ C7头痛□
C8腰背酸痛□ C9四肢酸痛□ C10咽 痛□ C11鼻塞□
C12流鼻涕□ C13打喷嚏□ C14恶 心□ C15呕吐□
C16腹泻□ ， 如有腹泻，每日大便 次 C17□□
3．有无以下并发症？（1有， 0无）
C18肺炎□ C19哮喘□ C20血小板减少性紫癜□
C21Reye，s综合征□ C22流产□ C23死胎□
4．血常规：WBC ，中性
5．X线胸片： 。 流感疫苗接种情况
1．有无接种？（1有，2无） D1□
2．最后一次接种日期： 年 月 日 D2□□□□□□□□
3．疫苗商品名： 厂家；
4．接种方式及部位： ；
5．接种地点： 。 实验室诊断
1．快速诊断：方法 结果：（1）甲型 （2）乙型 E1□
诊断时间： 年 月 日 E2□□□□□□□□
2．病毒分离，方法： 鸡胚E3□ 细胞E4□
鉴定：（1） 甲1 ；（2） 甲3； （3） 乙型；（4） 其他；（5）待定 E5□
鉴定时间： 年 月 日 E6□□□□□□□□
3．双份血清诊断型别为：（1）甲1；（2）甲3；（3）乙型；（4）其他；（5）待定E7□
诊断时间： 年 月 日 E8□□□□□□□□
测定抗体所用抗原： ；
4.其他诊断方法 及结果 ：
诊断时间： 年 月 日 E9□□□□□□□□ 流行病学调查
1．传染源调查
1）病前7日内接触流感样病人：（1）是；（2）否 F1□
接触程度：（1）一般； （2）密切 F2□
2）病前7日内禽、畜接触史？（1）有； （2）无 F3□
接触地点： ；接触动物名称： ；
接触方式： ；
接触频率：（1）经常；（2）不经常；（3）偶而 F4□
动物健康状况：（1）健康；（2）患病；（3） 病死 F5□
2．疫点环境卫生状况
1）住宅情况 F6□
（1）居民楼 ；（2）合住院落；（3）独立房屋；（4）集体宿舍
家庭人均居住面积： 平方米 F7□□.□
开窗情况：（1）经常；（2）偶而；（3）不开 F8□
如使用空调，近7天平均 小时/天 F9□□.□
2）住宅周围卫生：（1）好； （2）一般；（3）差 F10□
农贸市场：（1）有；（2） 无 F11□
距离市场： 米 F12□□□□
禽、畜养殖场所：（1）有； （2）无 F13□
距离养殖场： 米 F14□□□□
动物品种：
3）传播途径调查（1是，2否）
（1）与病人同处一室 F15□
（2）与病人有密切的接触 F16□
（3）与病人共用食具、茶具、毛巾、玩具等 F17□
（4）接触动物分泌物、排泄物、羽毛等 F18□ 调查者意见：
病例诊断：（1）流感样病例 （2）临床诊断病例 （3）实验室确诊病例G1□
可能传染源： ；
可能传播途径： 。
调查单位： .
调查者： 调查时间：
表8
调查单位/地址： 联系人 联系电话：
编号 | 姓名 | 性别 | 年龄 | 部门 /住址 | 发病日期 | 临床症状及检查 | 是否接种流感疫苗 | 是否接触病死禽畜 | 是否接触类似病例 | 采样日期 | 样品类型 | 实验室结果 | 备注 | ||||||||||
最高体温（度） | 咳嗽 | 咽痛 | 头晕 | 头痛 | 眼结膜充血 | 流鼻涕 | 打喷嚏 | 腹泻 | 并发症 | WBC 计数 | |||||||||||||
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注：（1）接触病、死禽是指病前7日内病、死禽、畜及其分泌、排泄物接触史。
（2）接触类似病例指：病前7日内接触流感样病人。
调查员： 调查日期： 年 月 日
表9
报告单位： 疾病控制中心 首次报告时间： 年 月 日 疫情概况
事件发生详细地点： 省 市 县（区） 乡（镇、街道） 村（社区、居委会）
1.单位名称： 2.单位人数： 人
若为学校，学生： 人 老师： 人
2．首例病例发病时间： 年 月 日，末例病例发病时间： 年 月 日
3．病例年龄分布：
年龄分组 | 发病数 | 其中死亡病例数 |
0～ |
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5～ |
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15～ |
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25～ |
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60～ |
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合计 |
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4．病例发病时间分布：（请画出病例发病时间分布图）
5．病例发病班级分布： 环境状况调查： 采样
咽拭子： 份 急性期和恢复期血清： 份
具体采样登记表见表2。 疫情性质
流感暴发病毒型别：A（H1N1）、A（H3N2）、B、其它：
其它： 疫情小结：
报告人 报告单位
单位盖章：
表10
项目分类 | 具体项目内容 | 分值 | 评分标准 | 得分 | |
市（区） 卫 生 局 | 组织领导 | 组织机构建设 | 2 | 市（区）卫生局、市（区）疾病预防控制中心领导有专人负责得1分，组织机构健全得1分 |
|
下发文件 | 2 | 市（区）卫生局向监测医院及疾病预防控制中心下发有关文件得2分，未下发文件不得分 |
| ||
卫生局对医院和市疾病预防控制中心的督导 | 2 | 有市（区）内督导或考核记录得2分 |
| ||
流感工作有关的会议记录 | 2 | 有工作会议纪要得2分，否则不得分 |
| ||
经费 | 项目下拨专项经费使用情况 | 3 | 有详细经费使用记录得1分，经费专用得1分，提供给监测医院一定的资料收集及采样费用、补助得1分 |
| |
市区卫生局经费投入 | 3 | 经费1：1配套得3分，1：0.5得2分，1：0.5以下得1分，无经费投入不得分 |
| ||
市（区）疾 病 预 防 控 制 中 心 | 人员 | 技术人员配备 | 3 | 市CDC至少有2名专职人员（流行病学及实验室技术人员）得3分，只有1人得1分，无专职固定人员不得分；区CDC有相对固定人员 |
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资料收集 和报告 | 市、区疾病预防控制中心收集及上报省疾病预防控制中心资料 | 10 | 上报表3、4、5完整得3分，缺1个月扣1分； 及时性：及时得3分，不及时扣1分； 规范性：使用统一表格得2分，不规范、不统一扣2分； 原始资料保存完整：各哨点报表保存完整得2分，不完整扣1分 |
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实验室建设 | 实验室配备 | 3 | 流感专用实验室得3分 |
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实验室规章制度 | 1 | 有严格的实验室规章制度得1分，否则不得分 |
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仪器设备及运转情况 | 12 | 现有设备能保证用鸡胚或细胞进行病毒分离得4分，能按规定时限进行病毒分离得4分，能开展快速诊断4分，否则不得分 |
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技术考核 | 6 | 操作正确得3分，分离鉴定结果正确得3分 |
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采样与毒株 分离 | 采样数 | 9 | 按照方案要求市全年完成至少405份，得9分，不达标扣4分；区全年完成至少180份，得9分，不达标扣4分，市/区断1周扣1分； |
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病毒分离数 | 15 | 市CDC分离60株以上得15分，50-59株得12分，40-49株得10分，30-39株得8分，30株以下得5分；区CDC 40株以上得15分，30-39株得12分，20-29株得10分，10-19株得8分，10株以下得5分，0株不得分。 |
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实验室记录 | 2 | 记录完整得2分 |
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毒株送检及时性 | 2 | 毒株送省、市疾病预防控制中心及时得2分，不及时不得分 |
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人员培训和 信息反馈 | 人员培训和理论知识考核 | 3 | 对本地区监测点人员进行技术培训，有完整培训记录和教材得2分； 派出人员参加技术培训、理论知识考试合格得1分 |
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与监测点的技术交流 | 2 | 向监测哨点反馈监测信息（检测结果、监测技术等）得2分 |
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总结 | 监测工作总结 | 2 | 市（区）疾病预防控制中心年终总结完整、及时得2分 |
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监测机构 | 监测医院资料收集与报告 | 7 | 报表资料完整准确得2分，报告及时得2分，填写规范得1分，原始资料完整得2分。 |
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监测哨点现场采样 | 3 | 现场考核采样操作合格3分，不合格不得分。 |
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医护人员采样培训 | 4 | 定期开展得4分，并有相关培训记录，否则不得分 |
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知识考核 | 2 | 根据考核情况评分 |
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总分 | 100 |
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